DxFLEX Standardization Study

Vincenzo Di Ruocco, Marta Parra, Annabelle Chauveau, Margot Grandl, Mireia Dalmau, Jose Antonio Delgado | Beckman Coulter Life Sciences

Einführung

Bei der Immunphänotypisierung in der Durchflusszytometrie ist es wichtig, dass die Ergebnisse verschiedener Labore vergleichbar sind und echte biologische Veränderungen von technischen Artefakten unterschieden werden können ^1, ².

Die Standardisierung der Durchflusszytometrie ist ein komplexes Verfahren, das in der Literatur ausführlich beschrieben wird ^{4, 5}, viele andere Konzepte wie das Design der Panelmarker, die Probenaufbereitung, die Systemeinrichtung und die Überwachung der Geräteleistung gehören dazu. Aus Sicht des Benutzers sind die am schwierigsten zu kontrollierenden Aspekte: Gerät-Setup, Leistungsüberwachung, Berechnung der Kompensationsmatrix und die Einstellung der Spannung/Verstärkung an jedem Fluoreszenzdetektor.

Die tägliche Überwachung der Geräteleistung gewährleistet die Reproduzierbarkeit der Analyse und standardisiert auch die Positionen der Zellcluster in von verschiedenen Geräten erhaltenen Histogrammen ³. Durch die Einstellung von Spannung/Verstärkung, um die Kontrollpartikel an einem bestimmten Zielkanal zu platzieren, wird ein relativ ähnliches Gerät-Setup erreicht ^{4, 5}. Wenn ein oder mehrere Parameter außerhalb des Zielbereichs der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) liegen, kann die Systemleistung beeinträchtigt sein. Falls eine Neueinstellung erforderlich ist, muss die Änderung der Spannung/Verstärkung und die Anwendung dieser Änderungen auf die Einstellungen des Panels manuell vorgenommen werden. Dies macht die Standardisierung verschiedener Geräte schwierig und zeitaufwändig.

Das neue DxFLEX beinhaltet ein QK/Standardisierungsmodul, das Qualitätskontroll- und Standardisierungsverfahren automatisch ermöglicht. Die Qualitätskontrolle prüft die angemessene Signalstärke und Präzision des Geräts. Das Modul überwacht die MFI, verfolgt Verstärkungsänderungen für jeden spezifischen Assay und verknüpft diese direkt mit den Panel-Experimenteinstellungen für automatische Änderungen.

In diesem Dokument werden wir prüfen, wie ein vollständiger Standardisierungsprozess durchgeführt wird, und wir werden die Ergebnisse besprechen, die in einer multizentrischen Standardisierungsstudie erzielt werden,

Material und Methoden

Drei verschiedene DxFLEX wurden in der Studie standardisiert. Sie befanden sich an folgenden Standorten:

Universität Leipzig, Deutschland.
Hospital Universitario Doctor Peset, Valencia, Spanien.
Beckman Coulter FR, Paris, Frankreich.

Um die experimentelle Variabilität aufgrund von Proben und Antikörperbearbeitung zu minimieren, wurden zusätzliche Lösungen von Beckman Coulter eingesetzt:

Proben: ClearLLab-Kontrollzellen Normal, ein Flüssigpräparat aus stabilisierten humanen Erythrozyten und Leukozyten zur Überprüfung der Genauigkeit/Reproduzierbarkeit der Schritte bei der Immunphänotypisierung. (Beckman Coulter PN. B90002)
MoAb-Panel-Kombination: DURAClone IM Phenotyping Basic Tube Kit*, von Experten entwickeltes, trockenes Antikörper-Panel für klinische Forschungsstudien, das die fehleranfällige Antikörperpipettierung und umfangreiches Reagenzmanagement der Reagenzien überflüssig macht. (Beckman Coulter PN. B53309)

Abb. 1. DURAClone IM Phenotyping Basic Tube ist nur für Forschungszwecke und nicht für die Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Zusätzliches Material:

Kunststoff-Reagenzgläser 12 x 75 mm
PBS-Puffer (Beckman Coulter PN. 6603369)
Flow-Set Pro Beads (Beckman Coulter PN. A63492*)
Versalyse Lysierlösung (Beckman Coulter PN. B53309)
IOTest3 Fixierlösung (Beckman Coulter PN. A07800)
Zentrifuge zur Aufnahme der Probenröhrchen (normalerweise 12 x 75 mm)
Ausrüstung zur Handhabung von Blut und Antikörpern (Pipetten, Spitzen, Handschuhe usw.)

Färbeprotokoll und Arbeitsablauf des Experiments

Jedes Labor bereitete 5 Proben vor und zwar:

100 μl ClearLLab Control Cells Normal zu einem DURAClone-Röhrchen mit IM-Basic-Reagenz hinzufügen.
Bei hoher Geschwindigkeit 15 Sekunden lang vortexen.
15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), vor Licht geschützt, inkubieren.
2 ml VersaLyse hinzufügen.
50 μl IOTest3 Fixierlösung hinzufügen.
Bei hoher Geschwindigkeit 5 Sekunden lang vortexen.
20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), vor Licht geschützt, inkubieren.

Jede Probe wurde 3 Mal aufgenommen.

5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren.
Den Überstand ansaugen oder dekantieren und verwerfen.
Das Zellpellet vorsichtig abklopfen.
Das Zellpellet in 0,5 ml PBS resuspensieren.

Jede Probe wurde 3 Mal aufgenommen.

Abb. 2. Arbeitsablauf des Experiments.

Gerät-Setup

(KAPITEL 5 Gerätequalitätskontrolle und Standardisierung, KAPITEL 6 Datenerfassung und Probenanalyse, KAPITEL 7 Kompensation aus der DxFLEX IFU PN. C44966.AA)

Standardisierte Sollwerte

Um alle Proben unter den gleichen Bedingungen laufen zu lassen, wurden optimierte Einstellungen nach einem Verstärkungsprotokoll ermittelt, das beschrieben ist in der Technischen Mitteilung von Beckman „Characterization of Gains on the CytoFLEX“ (Dokument FLOW-656502.20).

FlowSet Pro (Beckman Coulter PN. A63492*) wurde mit den erhaltenen Einstellungen durchgeführt. Die daraus resultierenden medianen Fluoreszenzintensitäten wurden in das Standardisierungsinstrument aufgenommen und die .tgt-Datei wurde erstellt und an die Teilnehmer der multizentrischen Studie weitergegeben.

Erstellung der Standardisierungs-Zieldatei

Gehen Sie zum Menü „QK/Standardisierung“ und öffnen Sie „QK/Standardisierung starten“.
Gehen Sie zum Menü „Einstellungen“ und öffnen Sie die „Standardisierungs-Zielbibliothek“.
Klicken Sie auf „HINZUFÜGEN“.
Vervollständigen Sie die Standardisierungs-Zielbibliothek. Siehe Abb. 3

Abb. 3. Mit Flow Set Pro Lot 71 erhaltene DXFLEX-Zielwerte nach der Verstärkungsoptimierung. Daten nur für illustrative Zwecke.

OK auswählen, um den Sollwert zu speichern.
Wenn alle Werte eingeführt wurden, mit „Close“ schließen. Eine „Standardisierung-Zieldatei“ wird automatisch erstellt (FSpro-71.tgt). Die Datei wurde dann exportiert und an andere Teilnehmer der Studie weitergegeben, die sie in ihre Standardisierungsbibliothek importierten.

Durchführen eines Standardisierungsexperiments

Nachdem die tgt-Datei importiert wurde, kann die Standardisierung durchgeführt werden.
Öffnen Sie das QK/Standardisierungsmodul des SW
Wählen Sie Standardisierung.
- Überprüfen Sie, ob die Konfiguration des Systems die Standardkonfiguration (Default) ist.
- Überprüfen Sie die Einstellungen des Trägers, um die Position des Röhrchens auf dem Karussell zu fixieren.
Wählen Sie die Chargennummer des Flow-Set Pro aus (in diesem Fall 71).
Geben Sie 15-20 Tropfen (ca. 0,5 ml) Flow-Set-Pro-Beads in ein Röhrchen und führen Sie das Standardisierungs-Tool aus.
Die erhaltenen Verstärkungen sind mit „Standardeinstellungen“ gekennzeichnet. Sie werden automatisch als „S“-Einstellungen in der Bibliothek gespeichert.
Diese Einstellungen werden jedes Mal automatisch aktualisiert, wenn das Standardisierungsprotokoll durchgeführt wird.

Erstellung der Kompensationsmatrix

Die Kompensationsmatrix wurde mithilfe der automatischen Kompensationsanwendung von DxFlex erstellt (siehe DxFLEX IFU).

Die mit IM Basic Kompensations-Kit-Röhrchen gefärbten ClearLLab-Kontrollzellen wurden mit „Standardeinstellungen“ erfasst.

Die daraus resultierende „IM Basic-Kompensation“ wurde in der DxFLEX-Kompensationsbibliothek gespeichert.

Erstellung und Einrichtung des Panel-Experiments

Wählen Sie „Datei → Neues Panel-Experiment“.
Wählen Sie Standort und einen Namen, z. B. „IM Basic Standardization Experiment“.
Neue leere Probe hinzufügen, und mit der rechten Maustaste auf die erzeugte Probe 1 klicken und „Neues Röhrchen“ wählen.
„Einstellungen → Kanal einstellen“ wählen: die entsprechenden Kanäle auswählen und die Beschriftung eingeben. Schließen („Close“)

Abb. 5. Fenster „Label setzen“.

Mit der rechten Maustaste auf „Röhrchen 1“ und „Link zu Einstellungen aus dem Katalog“ klicken. Link zu standardisierten „Standard-Einstellungen“.
Importieren Sie die Kompensationsmatrix durch Auswahl von „Kompensationsmatrix: Aus der Bibliothek importieren.
Wählen Sie die Kompensationsmatrix „IM Basic Compensation“ und importieren Sie nur die Kompensationsmatrix.

Abb. 6. Fenster „Kompensation importieren“.

Erstellen Sie das Arbeitsblatt zur Erfassung.

Abb. 7. Beispiel für eine Analyse mit der Cytexpert for DxFLEX Software. Plots dienen nur zu illustrativen Zwecken.

Benennen Sie „Tube 1“ in „1 run“ um und klicken Sie „Duplicate without data“ zweimal, um die dreifachen Läufe für die Probe zu erzeugen.

Klicken Sie in der rechten Maustaste auf „Sample 1“ und fünfmal „Duplicate without data“, um die komplette Erfassungsarbeitsliste zu erstellen. Hinweis: Diese Arbeitsliste wird zweimal unter verschiedenen Probenverfahren durchgeführt: vor dem Waschvorgang und nach einem Waschzyklus

Probenerfassung

Jede Probe wurde dreimal nach der Lyse, vor dem Waschen und dreimal nach dem Waschen erfasst, wobei die zuvor erstellte Kompensation und die Einstellungen verwendet wurden. Die Erfassung wurde bei schnellem Tempo durchgeführt und die Stoppbedingung am „Leukozyten-Gate“ wurde auf 50.000 eingestellt.

Datenanalyse: Gating-Strategie und Off-Line-Kompensation

Die Daten der 3 Auswertungsgeräte wurden gesammelt und mit Kaluza C analysiert, wobei dieselbe Gating-Strategie und Kompensation angewendet wurde.

Die ausgewerteten Daten wurden für die statistische Analyse in Excel exportiert.

Abb. 9. Beispiel einer Gating-Strategie mit der Software Kaluza C.

Abb. 10. Für die Analyse verwendete Kompensationsmatrix. Die daten dienen nur zu illustrativen Zwecken.

Ergebnisse und Diskussion

Einfluss des Probenverfahrens auf das Ergebnis

Es wurde ein gepaarter t-Test durchgeführt, wie in Abb. 11 dargestellt, und die Daten zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen gewaschenem und nicht gewaschenem Verfahren.

Abb. 11. Gepaarte t-Test-Daten, jeder Punkt ist der Median von 5 Proben. Die Prozentsätze der Lymphozyten und Monozyten
wurden über die Gesamtleukozyten, alle anderen Populationen über die Gesamtmenge der Lymphozyten berechnet.

Es wurde eine zusätzliche statistische Auswertung durchgeführt, wie in Grafik 1 dargestellt. Die Durchschnittswerte zwischen gewaschenem und nicht gewaschenem Probenverfahren sind ähnlich. Außerdem wurden Standardabweichung und Variationskoeffizient berechnet und alle durchschnittlichen CVs für verschiedene Zentren sind kleiner als 2,5 %.

Tabelle 1. Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten der Ergebnisse nach gewaschenem und nicht gewaschenem Probenverfahren.

Eine einzige standardisierte Einstellung sowohl für nicht gewaschene als auch für gewaschene Proben minimiert die Komplexität der Kalibrierung des Gerät-Setups, vereinfacht den Arbeitsablauf, da mehrere Anwendungen mit denselben eindeutigen Standardeinstellungen verbunden werden können, und spart demzufolge Kosten und Zeit im Labor.

Ergebnisse innerhalb eines Labors: Genauigkeit mit dem gleichen Gerät

Die sich nach der ANOVA-Analyse in Abb. 12 ergebenden Daten zeigen keine statistischen Unterschiede zwischen den Proben für jede Population in beiden Probenverfahren.

Abb. 12. Daten der Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen, jeder Punkt ist der Medianwert von 3 Wiederholungen. Die Prozentsätze der Lymphozyten und Monozyten
wurden über die Gesamtleukozyten, alle anderen Populationen über die Gesamtmenge der Lymphozyten berechnet.

Da wir nachgewiesen haben, dass es keinen signifikanten Unterschied im Probenverfahren gibt, wurden alle Daten zusammengefasst und gemeinsam ausgewertet. Die sich daraus ergebenden CVs spiegeln die Variationen innerhalb des Labors wider. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, sind alle durchschnittlichen CVs für die verschiedenen Zentren kleiner als 2,5 %.

Tabelle 2. Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten der Ergebnisse beim Poolen von gewaschenen und nicht gewaschenen Daten.

Eine geringer Variationskoeffizient zwischen den Probenreplikaten ist entscheidend für den Nachweis, dass ein Assay gut durchgeführt wurde und die erhaltenen Daten präzise und genau sind. Alle Zentren zeigen eine hohe Konsistenz der Daten in den einzelnen detektierten Population zwischen den verschiedenen Aufnahmen, entweder in nicht gewaschenen oder gewaschenen Probenpräparationen. Dies weist auf eine hohe laborinterne Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Methode hin.

Ergebnisse innerhalb eines Labors: Genauigkeit über mehreren Zentren hinweg

Die Daten verschiedener Zentren wurden analysiert, um die Variabilität zwischen den Laboren zu bewerten. Die ANOVA-Analyse in Abb. 13 zeigt, dass für keine Population statistische Unterschiede zwischen den Laboren gefunden wurden.

Abb. 13. Labor 1: Paris, Labor 2: Leipzig, Labor 3: Valencia.
Daten der Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen, jeder Punkt ist der Medianwert von beiden Verfahren in 5 Proben. Die Prozentsätze der Lymphozyten und
Monozyten wurden über die Gesamtleukozyten, alle anderen Populationen über die Gesamtmenge der Lymphozyten berechnet.

Daten der Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen, jeder Punkt ist der Medianwert von beiden Verfahren in 5 Proben. Die Prozentsätze der Lymphozyten und Monozyten wurden über die Gesamtleukozyten, alle anderen Populationen über die Gesamtmenge der Lymphozyten berechnet.

Alle Daten wurden zusammen analysiert und der durchschnittliche CV ist kleiner als 2,5 %, wie in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten – Ergebnisse bei Betrachtung aller Daten
(gewaschene und nicht gewaschene Daten) aus verschiedenen Zentren.

Darüber hinaus wurden in der Studie auch Bilder ausgewertet. Insbesondere wurden Histogramm-Overlays durchgeführt und die Variabilität der positiven Population MFI (mittlere Fluoreszenzintensitäten) zwischen den Zentren analysiert.

Abb. 14. Histogramm-Overlays der detektierten Populationen zwischen verschiedenen Zentren. Die für die statistische Analyse verwendeten MFI werden angezeigt.

Die MFI wurden analysiert und der durchschnittliche CV ist kleiner als 3,5 %, wie in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4. Histogramm-MFI-Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten aus verschiedenen Zentren.

Die Daten bezüglich % und MFI zeigen, dass kein statistischer Unterschied zwischen den Zentren festgestellt wurde. Die Konsistenz zwischen den Laboren ermöglicht eine experimentelle Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse.

Zusammenfassung

Vereinfachter Standardisierungs-Setup-Workflow auf einer oder zwischen verschiedenen DxFLEX-Plattformen.

Ein optimierter Arbeitsablauf für die Einrichtung der Standardisierung von Anwendungen verbessert die Effizienz von klinischen Forschungsstudien. Die DxFLEX-Plattform bietet eine eingebaute Standardisierungsfunktion in der Software „CytExpert for DxFLEX“, die eine tägliche Autokalibrierung der Verstärkungseinstellungen unter benutzerdefinierten Zielwerten ermöglicht und dieselben Zielwerte auf verschiedenen DxFLEX-Plattformen für dieselbe Anwendung implementiert.

Um die Variation des Studienergebnisses zwischen den Laboren zu reduzieren und die Übereinstimmung zwischen klinischen Forschungszentren zu verbessern, zeigen wir in diesem White Paper, dass das DxFLEX-System von Beckman Coulter einen vereinfachten und zuverlässigen Standardisierungs-Workflow bietet und dabei geräteübergreifend konsistente Ergebnisse bei Zellproben geliefert werden.

Literaturhinweise

Lacombe, F. et al. Harmonemia: a universal strategy for flow cytometry immunophenotyping-A European LeukemiaNet WP10 study. Leukemia 30, 1769–1772 (2016).
Kalina, T. et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols . Leukemia 26, 1986–2010 (2012).
Schwartz, A., Marti, G. E., Poon, R., Gratama, J. W. & Fernández-Repollet, E. Standardizing flow cytometry: A classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry (1998). doi:10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:2<106::aid-cyto4>3.0.CO;2-H
Maecker, H. T., McCoy, J. P. & Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. 12, 191–200 (2012).
Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P. & Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1522–1530 (2006).

DxFLEX ist ein IVD-Instrument, das nur in Ländern erhältlich ist, in denen die behördliche Zulassung von den lokalen Aufsichtsbehörden erteilt wird. Bitte erkundigen Sie sich bei Ihren örtlichen Vertriebsmitarbeitern, bevor Sie Ihre Bestellungen aufgeben.

* DURAClone IM Phenotyping Basic Tube ist nur für Forschungszwecke und nicht für die Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

FlowSet Pro: Nur für Forschungszwecke. Nicht für den Einsatz in Diagnoseverfahren.

FlowSet Pro wurde nicht als Bestandteil des DxFLEX CE-Systems validiert und dient nur als Beispiel zur Veranschaulichung des allgemeinen Standardisierungsprozesses. DxFLEX Daily QC Fluorospheres oder andere Referenzmaterialien, die für die jeweiligen Anwendungen relevant sind, können als Standardisierungsprobe verwendet werden.

Multi-Center DxFLEX Standardization Project

Introduction

In flow cytometry immunophenotyping, it is essential that results are comparable among laboratories, distinguishing true biological changes from technical artifacts^{1, 2}.

Flow cytometry standardization is a complex procedure widely reviewed in the literature^{4, 5}, which includes many other concepts like panel marker design, sample processing, system setup and instrument performance monitoring. From a user point of view, the most difficult aspects to control are: instrument setup, performance monitoring, compensation matrix calculation and the setting of voltage/gain applied to each fluorescence detector.

Daily instrument performance monitoring ensures reproducibility of the analysis and also standardizes the positions of cell clusters in histograms obtained from different instruments³. By setting voltage/gain to place the control particles at a particular target channel, a relatively similar instrument setup is achieved^{4, 5}. If one or more parameters are out of range from the target MFI (Mean Fluorescence Intensity), the system performance could be compromised. In case a readjustment is needed, the voltages/gains modification and the application of these changes to the panel’s settings must be done manually. This makes standardization among different instruments difficult and time consuming.

The new DxFLEX includes a QC/Standardization module that automatically enables instrument quality control and standardization procedures. Quality control checks the adequate signal strength and precision of the instrument. The module monitors the MFI, tracks gain changes for any specific assay and directly links them to the panel experiment settings for automatic modifications.

In this paper we will review how to perform a complete standardization process and we will discuss the results obtained in a multicenter standardization study.

Material and Methods

Three different DxFLEX have been standardized in the study. They were located at:

University of Leipzig, German.
Hospital Dr Peset, Valencia, Spain.
Beckman Coulter FR, Paris, France.

In order to minimize the experimental variability due to samples and antibody handling, additional Beckman Coulter solutions have been adopted:

Samples: ClearLLab Control Cells Normal, a liquid preparation of stabilized human erythrocytes and leukocytes to verify the accuracy/reproducibility of the steps involved in immunophenotyping. (Beckman Coulter PN. B90002)
MoAb Panel combination: DURAClone IM Phenotyping Basic Tube kit*, expert-designed dry antibody panel for clinical research studies, which eliminates error-prone antibody pipetting and extensive reagent inventory management. (Beckman Coulter PN. B53309)

Fig. 1. DURAClone IM Phenotyping Basic Tube is for Research Use Only, not for use in diagnostic procedure.

Additional material:

Plastic test tubes 12 x 75 mm
PBS Buffer (Beckman Coulter PN. 6603369)
Flow-Set Pro beads (Beckman Coulter PN. A63492*)
Versalyse lysing solution (Beckman Coulter PN. B53309)
IOTest3 Fixative Solution (Beckman Coulter PN. A07800)
Centrifuge accepting the sample tubes (typically 12x75 mm)
Equipment to handle blood and antibodies (pipettes, tips, gloves, etc.)

Staining protocol and experiment workflow

Every lab prepared 5 samples as follows:

Add 100 μL of ClearLLab Control Cells Normal to an IM Basic reagent DURAClone tube.
Vortex at high speed for 15 second.
Incubate for 15 minutes at room temperature (RT), protected from light.
Add 2 mL of VersaLyse.
Add 50 μL IOTest3 Fixative Solution.
Vortex at high speed for 5 seconds.
Incubate for 20 minutes at room temperature (RT), protected from light.

Each sample was acquired 3 times

Centrifuge at 200 x g for 5 minutes.
Aspirate or decant the supernatant and discard.
Gently tap the cell pellet.
Re-suspend cell pellet in 0.5 mL PBS.

Each sample was acquired 3 times

Fig. 2. Experiment workflow.

Instrument setup

(CHAPTER 5 Instrument Quality Control and Standardization, CHAPTER 6 Data Acquisition and Sample Analysis, CHAPTER 7 Compensation from the DxFLEX IFU PN. C44966.AA)

Standardized Target values

In order to run all samples under the same conditions, optimized settings were obtained following a gaintration protocol described on the Beckman Technical Note “Characterization of Gains on the CytoFLEX” (document FLOW-656502.20).

FlowSet Pro (Beckman Coulter PN. A63492*) was run with the obtained settings. The resulting median fluorescence intensities were added into the standardization tool and the .tgt file generated and shared across the participants in the multicenter study.

Standardization target file generation

Go to the “QC/Standardization” menu and open “Start QC/Standardization.
Go to the “Settings” menu and open “Standardization Target Library”.
Click “ADD”.
Complete the standardization target library. See Fig. 3

Fig. 3. DXFLEX targets obtained with Flow Set Pro Lot 71 after gain optimization. Data for illustrative purposed only.

Select OK to save the target value.
Once all the values are introduced, “Close”. A “standardization target file” is automatically generated (FSpro-71.tgt). The file was then exported and shared with other participants in the study, who imported it into their standardization library.

Running a standardization experiment

Once the tgt file was imported, the standardization can be performed.
Open the QC/Standardization module of the sw
Select Standardization.
- Check the configuration of the system is the Default one.
- Check the Carrier settings to fix the position of the tube on the carrousel.
Select the Flow-Set Pro lot number (In this case, 71).
Dispense 15-20 drops (about 0.5 mL) of Flow Set Pro Beads in a tube and run the standardization tool.
The obtained gains are labelled “Standard settings”. They are automatically saved in the library as “S” settings.
These settings will be automatically updated each time the standardization protocol is run.

Compensation matrix generation

Compensation matrix was generated using the automatic compensation application from DxFlex (Please refer to DxFLEX IFU).

ClearLLab control Cells, stained with IM Basic compensation kit tubes have been acquired with “Standard settings”.

The resulting “IM Basic compensation” was saved into the DxFLEX Compensation Library.

Panel experiment creation and set up

Select ‘File → New Panel Experiment’.
Select location and a name, e.g. ‘IM Basic standardization experiment’.
Add New Empty sample, and on the generated Sample 1 right click and select “new tube”.
Select ‘Settings → Set Channel’: select the corresponding channels and enter the label description. “Close”.

Fig. 5. Set label window.

Right click on the “Tube 1” and “Link to Settings from Catalog”. Link to the standardized “Standard settings”.
Import the compensation matrix by selecting ‘Compensation Matrix: Import from Library’.
Select the ”IM Basic compensation” compensation matrix and import compensation matrix only.

Fig. 6. Import compensation window.

Generate the acquisition worksheet.

Fig. 7. Example of Analysis in Cytexpert for DxFLEX software. Plots are for illustrative purposes only.

Rename “Tube 1” as “1 run” and “Duplicate without data” two times to generate the triplicate runs for the sample.

Right click on Sample 1 and “Duplicate without data” five times in order to create the complete acquisition worklist. NB: This worklist will be run twice under different sample procedures: before wash and after 1 wash cycle

Sample acquisition

Every sample was acquired 3 times after lysis, before washing, and 3 times after washing, using the compensation and settings previously generated. Acquisition was performed at fast speed and stop condition was set at 50,000 on the “Leucocytes” gate.

Data analysis: Gating Strategy and off line compensation

Data from the 3 evaluation instruments were collected and analyzed in Kaluza C, where the same gating strategy and compensation have been applied.

Analyzed data have been exported for Excel statistical analysis.

Fig. 9. Example of gating strategy in Kaluza C software.

Fig. 10. Compensation matrix applied for analysis. Data are for illustrative purposes only.

Results & Discussion

Sample procedure impact on the result

Paired t test data was performed, as shown in Fig. 11, and the data shows no significant difference between washedand no washed procedure.

Fig. 11. Paired t test datas, each point is the median of 5 samples. Lymphocytes and Monocytes percentages have been calculated over total leucocytes, all the other populations over the total amount of lymphocytes.

Additional statistic evaluation was performed, as shown in chart 1, average values between washed and no washedsample procedure are similar. Furthermore, standard deviation and coefficient variation have been calculated and all average CVs for different sites are less than 2.5%.

Chart 1. Averages, Standard Deviations and Coefficient Variations results after washed and no washed sample procedure.

Having one standardized setting only for both no washed and washed procedures minimizes complexity in instrument setup calibration, simplifies the workflow since multiple applications can be linked to the same unique standardize settings and consequently saves laboratory costs and time.

Intra lab result: accuracy within the same instrument

Data resulting after ANOVA analysis in Fig. 12 show no statistical differences between samples for each population in both sample procedures.

Fig. 12. Repeated measures one-way ANOVA datas, each point is the median of 3 repetitions. Lymphocytes and Monocytes percentages have been calculated over total leucocytes, all the other populations over the total amount of lymphocytes.

Since we demonstrated there is no significant difference in sample procedure, all data have been pooled and analyzed together. Resulting CVs reflect intra lab variation and, as shown in chart 2, all average CVs for different sites are less than 2.5%.

Chart 2. Averages, Standard Deviations and Coefficient Variations results when pooling washed and no washed data.

Having a low coefficient of variability between sample replicates is crucial in demonstrating an assay was well-run and the resultant data is precise and accurate. All the centers show high consistency data in each detected population among the different acquisitions, either in no washed or washed sample preparations. It shows high intra lab reliability and accuracy of the method.

Intra lab results: Accuracy across multiple sites

Data from different centers have been analyzed in order to evaluate inter lab variability. ANOVA analysis in Fig. 13 shows no statistical diferences were found between laboratories for each population.

Fig. 13. Lab 1: Paris, Lab 2: Leipzig, Lab 3: Valencia. Repeated measures one-way ANOVA datas, each point is the median of both procedures in 5 samples. Lymphocytes and Monocytes percentages have been calculated over total leucocytes, all the other populations over the total amount of lymphocytes.

Repeated measures one-way ANOVA datas, each point is the median of both procedures in 5 samples. Lymphocytes and Monocytes percentages have been calculated over total leucocytes, all the other populations over the total amount of lymphocytes.

All the data have been analysed together and average CV is less than 2.5%, as shown in chart 3.

Chart 3: Averages, Standard Deviations and Coefficient Variations results when considering all data (washed and no washed data) from different centers.

In addition, images have been also evaluated in the study. In particular, histogram overlays have been performed and positive population MFI (Mean Fluorescence Intensities) variability between centers have been analyzed.

Fig. 14. Histograms overlays of the detected populations between different centers. MFI used for statistical analysis are displayed.

MFI have been analyzed and average CV is less than 3.5%, as shown in chart 4.

Chart 4. Histogram MFI Averages, Standard Deviations and Coefficient Variations results from different centers.

Data regarding % and MFI showed no statistical difference across centers has been detected. Inter lab consistency enables experimental reproducibility and result reliability.

Conclusion

Simplified standardization setup workflow on one or between DxFLEX platforms.

A streamlined application standardization setup workflow will improve efficiency in clinical research studies. The DxFLEX platform provides a built-in standardization function in the CytExpert for DxFLEX software, which enables daily auto-calibration of gain settings under user defined target values and implements the same target values on different DxFLEX platforms for the same application.

In order to reduce variation in study outcome between laboratories and improve consistency between clinical research sites, in this white paper we demonstrate that Beckman Coulter DxFLEX system provides a simplified and reliable standardization workflow, while delivering consistent results on cell samples across instruments.

References

Lacombe, F. et al. Harmonemia: a universal strategy for flow cytometry immunophenotyping-A European LeukemiaNet WP10 study. Leukemia 30, 1769–1772 (2016).
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Schwartz, A., Marti, G. E., Poon, R., Gratama, J. W. & Fernández-Repollet, E. Standardizing flow cytometry: A classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry (1998). doi:10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:2<106::AID-CYTO4>3.0.CO;2-H
Maecker, H. T., McCoy, J. P. & Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. 12, 191–200 (2012).
Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P. & Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry . Nat. Protoc. 1, 1522–1530 (2006).

DxFLEX is an IVD instrument that is available only in countries where the regulatory approval is obtained from the local regulatory agencies. Please check with your local sales representatives before placing your orders.

* DURAClone IM Phenotyping Basic Tube is for Research Use Only, not for use in diagnostic procedures.

FlowSet Pro: Research Use only. Not for use in diagnostic procedures.

FlowSet Pro has not been validated as part of the DxFLEX CE system and is only meant to serve as an example to demonstrate the general standardization process. DxFLEX Daily QC Fluorospheres or any other reference material that is relevant for your applications may be used as the standardization samples.