Übersicht

  • Hohe Ausbeute und Reinheit von RNA oder Gesamt-Nukleinsäure
  • Keine Zentrifugierung, Vakuumfiltration oder Lösungsmittel erforderlich
  • Unterstützt automatische oder manuelle Extraktionsmethoden

Anwendung:  Isolierung der Gesamt-RNA oder der Gesamt-Nukleinsäure aus FFPE-Gewebeproben
Downstream-Anwendungstechniken: qRT-PCR, microarray

Prozessüberblick

A - B. Lyse von Gewebe und Freisetzung von Nukleinsäuren.1. Bindung von Nukleinsäuren an magnetische Beads  2. Separation von Beads 3. Waschung der Ausbeute-Produkte mit 70-prozentigem Ethanol 4.Waschung mit Isopropanol zur Abscheidung von Verunreinigungen 5. Waschung mit 70-prozentigem Ethanol 6. Elution von Nukleinsäuren aus magnetischen Partikeln.

Gewinnung fragmentierter Nukleinsäure

Die Fixierung von Gewebeproben in Formaldehyd kann zu einer umfangreichen Vernetzung von Gewebebestandteilen führen. Die Qualität von Nukleinsäure hängt von einer Anzahl an Faktoren ab, einschließlich der Durchführung der Formalinfixierung, dem Alter der Probe, der Lagerbedingungen usw. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde Nukleinsäure diverser FFPE-Probentypen und -Altern mit dem Agencourt FormaPure-Prozess isoliert und erfolgreich mittels PCR amplifiziert.

Nukleinsäure-Gewinnung

Abbildung 1. Die Gesamt-Nukleinsäure wurde bei jedem Gewebe aus 5-Mikron-Schnitten isoliert. Das Elutionsvolumen betrug 40 µl. Zwei (2) µl an eluiertem Produkt wurden in einer 20-µl-PCR-Reaktion (45 Zyklen) verwendet, um die 300-bp-Region des GAPDH-Gens zu amplifizieren. An einer 10-µl-Probe wurde auf einem 2-prozentigen Agarose-Gel eine Elektrophorese vorgenommen. Lane 9 enthält die negative Kontrolle. Lane 10 enthält eine 1-kb-Leiter.

Konsistente RNA-Reinheit

Das Agencourt FormaPure-System ermöglicht eine konsistente RNA-Ausbeute und -Reinheit. Tabelle 1 umfasst Daten von fünf biologischen Rattenlungen-FFPE-Replikaten, die mittels Agencourt FormaPure aufgereinigt wurden. Es zeigten sich konsistente Verhältnisse von 1,79 bis 1,83 für 260/280 und 1,06 bis 1,21 für 260/230. Die Agilent*-Bioanalyzer-Traces derselben Proben zeigen eine konsistente RNA-Reinheit und Fragmentgewinnung (Abbildung 2).

Tabelle 1.Betastellen-Daten für RNA, die mittels Agencourt FormaPure aus FFPE-Rattenlungengewebe aufgereinigt wurde. Für jedes Replikat wurde ein 10-Mikron-Schnitt verwendet.

RNA-Reinheit

Abbildung 2. Agilent-Bioanalyzer-Traces von RNA, mit dem Agencourt FormaPure-System aus mehreren FFPE-Rattenlungengeweben präpariert. Alle Proben wurden mit DNAse I behandelt.

Zusammenfassung

Das Agencourt FormaPure-System kann sowohl Gesamt-Nukleinsäure als auch Gesamt-RNA extrahieren und bietet ausgezeichnete Ausbeute und Reinheit sowie einen automatisierungsfreundlichen Prozess. Mittels dieser Technologie lassen sich Nukleinsäuren aus einer breiten Vielfalt an Gewebetypen zur Nutzung beispielsweise in der SNP-Genotypisierung, Genexpression und Sequenzierung aufreinigen. Durch die Nutzung paramagnetischer Beads sind keine Zentrifugierung, Vakuumfiltration oder chemische Lösungsmittel erforderlich. Das Agencourt FormaPure-System trägt zusammen mit den Beckman Coulter Biomek NXP oder FXP Span-8-Workstations dazu bei, die umfangreichsten aktuellen biologischen Fragen zu beantworten.