Method Comparison Study Comparing DxFLEX & FC500 Performance

Jack Sherwing, Guoyan Cheng, Robert Magari, Liliana Tejidor | Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA

Tabelle

Einführung

Das DxFLEX-Durchflusszytometer ermöglicht eine schnelle quantitative und multiparametrische Analyse an suspendierten Zellen oder anderen Biopartikeln auf Zellebene. Das DxFLEX-Durchflusszytometer beruht auf dem erfolgreichen Forschungszytometer CytoFLEX*. Das DxFLEX-Durchflusszytometer ist seit 2015 in China für den klinischen Einsatz zugelassen. Als fortschrittlicheres Durchflusszytometriesystem bietet das DxFLEX-Durchflusszytometer zusätzlich (i) mehr Fluoreszenzkanäle, (ii) eine hohe Empfindlichkeit (iii) und eine benutzerfreundlichere Software als sein Vorgänger, das Durchflusszytometer FC500. In dieser klinischen Studie wurde die Leistung des DxFLEX-Durchflusszytometers bewertet, indem es mit dem FC500-Durchflusszytometer (dem Vorgänger) unter Verwendung des DuraClone B27-Reagenzienkits verglichen wurde. Das DxFLEX-Durchflusszytometer wurde in Verbindung mit DxFLEX Daily QC Fluorospheres untersucht. Alle Validierungen wurden mit dem DxFLEX-Durchflusszytometer in seiner Konfiguration mit 3 Lasern und 13 Detektoren durchgeführt.
Das humane Leukozytenantigen B27 (HLA-B27), ein Produkt des Haupthistokompatibilitätskomplexes, ist bekanntlich mit verschiedenen Krankheitszuständen einschließlich Spondylitis ankylosans, akuter anteriorer Uveitis und Reiter-Syndrom assoziiert (1). Der Durchflusszytometrie-Test hat sich als beliebteste Testmethode zum Screening auf das HLA-B27-Antigen erwiesen (2), da er zuverlässig, kostengünstig und relativ einfach durchzuführen ist (3,4). Dementsprechend kann die Verwendung vielseitigerer und empfindlicherer Durchflusszytometriesysteme für diese diagnostischen Bemühungen von enormem Nutzen sein.  

Materialien und Methoden

Das DxFLEX-Durchflusszytometersystem besteht aus Flüssigkeitsbehältern, einem Zytometer (einschließlich der Software CytExpert for DxFLEX) und dem optionalen Zubehör eines Autoloaders (ein standardmäßiges 32-Röhrchen-Karussell). Es ist für klinische Anwendungen vorgesehen und bietet Leistung, ein kompaktes Design sowie optimierte Installation und Betrieb. Es sind vier Konfigurationen mit bis zu 3 Lasern und 13 Detektoren erhältlich. Die Konfiguration mit 3 Lasern und 13 Detektoren wurde in dieser Studie verwendet, aber nur drei Kanäle (FITC, PE und PC5,5) wurden mit der Anwendung DuraClone B27 validiert. DxFLEX Daily QC Fluorospheres (PN C39283) ist eine Suspension fluoreszierender Mikrokügelchen, die zur Überprüfung der optischen Ausrichtung und des Flüssigkeitssystems des DxFLEX-Durchflusszytometers bestimmt ist. 

Bei der klinischen Studie des DxFLEX-Durchflusszytometers handelte es sich um eine Methodenvergleichsstudie, bei der das DxFLEX-Durchflusszytometer mit dem Durchflusszytometer FC500 verglichen wurde, während für eine qualitative Leistungsbewertung das Reagenzienkit DuraClone B27 verwendet wurde. Kurz gesagt, in K2EDTA gesammelte de-identifizierte restliche Vollblutproben wurden mit dem DuraClone B27-Reagenzienkit vorbereitet und die Proben wurden einmal mit dem FC500 und einmal mit dem DxFLEX-Durchflusszytometer aufgenommen. Die endgültigen Daten wurden vom gleichen Bediener vor Ort für beide Methoden analysiert und das Testergebnis für jede Probe qualitativ als HLA-B27 positiv (+), HLA-B27 negativ (-) oder HLA-B27 unbestimmt bewertet, was der DuraClone B27 IFU-Klassifikation entspricht. Es wurden zwei Zentren aufgenommen und insgesamt wurden mindestens 150 HLA-B27-positive (+) Proben und mindestens 150 HLA-B27-negative (-) Proben für die Erfassung angestrebt. Der gesamte Studienablauf ist unten in Abbildung 1 dargestellt. 

Die Studienendpunkte waren eine Beurteilung der qualitativen phänotypischen Übereinstimmung der DuraClone B27-Typisierung auf dem DxFLEX-Durchflusszytometer und dem FC500-Durchflusszytometer, einschließlich der positiven prozentualen Übereinstimmung (PPA), der negativen prozentualen Übereinstimmung (NPA) und der prozentualen Gesamtübereinstimmung (OPA). Für die PPA, NPA und OPA wurden zweiseitige 95 %-Konfidenzintervalle geschätzt. Das Ziel für die PPA, NPA und OPA betrug 90 %, wobei die untere Grenze des 95 %-Konfidenzintervalls bei 80 % lag. Die Scoring-Methode wurde zur Berechnung der zweiseitigen 95 %-Konfidenzintervalle verwendet. 

DxFLEX Daily QC Fluorospheres wurden verwendet, um die optische Ausrichtung und das Fluidiksystem der DxFLEX-Durchflusszytometer-Instrumente zu überprüfen. Laserverzögerung, Laserleistung, Verstärkung, MFI und rCV für alle dreizehn Fluoreszenzkanäle wurden an jedem Testtag während dieser Studie validiert (erfüllten erfolgreich die QK-Akzeptanzkriterien gemäß Gebrauchsanweisung des Instruments). 

Abbildung 1. Gesamtablauf der Studie 

Bild1

Statistische Analyse

Diese Analysen wurden durchgeführt, um die Studienendpunkte zu evaluieren. Die diagnostische Leistung des DxFLEX-Durchflusszytometers im Vergleich zum FC500 für die HLA-B27-Typisierung wurde mittels Berechnung der folgenden Parameter beurteilt: PPA (% der Proben HLA-B27 positiv (+) durch FC500, die auch durch das DxFLEX-Durchflusszytometer, Formel 1, als positiv identifiziert wurden), NPA (% der Proben HLA-B27 negativ (-) durch FC500, die auch durch das DxFLEX-Durchflusszytometer, Formel 2, als negativ identifiziert wurden) und OPA (Summe der % der Proben, die durch FC500 als HLA-B27 positiv (+) und HLA-B27 negativ (-) identifiziert wurden, die auch durch das DxFLEX-Durchflusszytometer, Formel 3, als positiv bzw. negativ identifiziert wurden). Siehe Tabelle 1. 

Tabelle 1. Matrix der Übereinstimmung

Tabelle 2

Formel 1: PPA = a/(a+b+c+i)

Formel 2: NPA = e/(d+e+f+h)

Formel 3: OPA = (a+e)/(a+b+c+i+d+e+f+h)

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 2. Demografische Daten von aufgenommenen und eingeschlossenen Spendern von Patientenproben 

Tabelle 1

Insgesamt wurden 377 Probendaten analysiert, um die Leistungsübereinstimmung zwischen dem DxFLEX-Durchflusszytometer und dem FC500 in dieser Studie zu bewerten. Siehe demographische Daten der Spender von Patientenproben in Tabelle 2 oben.

In dieser Studie wurden DxFLEX Daily QC Fluorospheres verwendet, um die optische Ausrichtung und das Fluidiksystem der DxFLEX-Durchflusszytometer-Instrumente zu überprüfen. Laserverzögerung, Laserleistung, Verstärkung, MFI und rCV für alle dreizehn Fluoreszenzkanäle wurden an jedem Testtag während dieser Studie validiert. Für den FC500 wurden QK-Tests mit FlowCheck Fluorospheres durchgeführt. Alle QK-Kriterien gemäß den Gebrauchsanweisungen der Instrumente wurden für beide Geräte an allen Testtagen erfüllt. 

Für die kombinierten Zentren stellten wir fest, dass 153 Proben bei beiden Geräten HLA-B27-positiv und 209 Proben bei beiden Geräten HLA-B27-negativ getestet wurden (Tabelle 3). Zwei (2) Proben waren bei beiden Geräten HLA-B27 unbestimmt. Außerdem gab es 13 Fälle, in denen HLA-B27 auf dem FC500 unbestimmt, auf dem DxFLEX Durchflusszytometer-Instrument jedoch HLA-B27 positiv war; diese wurden als diskordante Proben klassifiziert. 

Für das Zentrum 1 wurden insgesamt 221 Proben aufgenommen, wobei 102 Proben sowohl beim DxFLEX-Durchflusszytometer als auch beim FC500-Test HLA-B27-positiv waren und 108 Proben bei beiden Tests HLA-B27-negativ waren (Tabelle 4).  Insgesamt 11 Proben wurden beim FC500-Test als HLA-B27-unbestimmt betrachtet, während sie beim DxFLEX-Durchflusszytometer als positiv gemeldet wurden.

Für das Zentrum 2 wurden insgesamt 156 Proben aufgenommen, 51 waren HLA-B27-positiv für beide Geräte und 101 waren negativ für beide Geräte (Tabelle 5). Zwei (2) Proben wurden auf dem FC500 HLA-B27-unbestimmt getestet, auf dem DxFLEX-Durchflusszytometer jedoch HLA-B27-positiv. Zwei weitere (2) Proben testeten sowohl auf dem FC500 als auch auf dem DxFLEX Durchflusszytometer HLA-B27-unbestimmt.
Nach einer weiteren Untersuchung der 11 diskordanten Proben aus Zentrum 1 wurde festgestellt, dass weder das Alter des Präparats noch das Alter der Probe einen Einfluss auf diese beobachtete Diskordanz hatte. Interessanterweise stimmten die LDT-Ergebnisse für diese diskordanten Proben mit denen des DxFLEX-Durchflusszytometers überein und waren für alle 11 Proben HLA-B27-positiv. Die 2 ausstehenden Diskordanten-Proben der Studie 2 wiesen keine LDT-Ergebnisse auf.

Aufgrund dieser Ergebnisse spekulieren wir, dass die beobachtete Diskordanz zum Teil auf den Unterschied in der Geräteempfindlichkeit und Auflösung zwischen dem DxFLEX-Durchflusszytometer und dem FC500 zurückzuführen sein könnte. Da das DxFLEX-Durchflusszytometer das empfindlichere der beiden Geräte ist, hat es auch eine bessere Auflösung (Auflösung von 7 Dekaden) als das FC500 (Auflösung von 4 Dekaden). Die höhere Empfindlichkeit des Instruments bedeutet, dass das Instrument über eine bessere Fähigkeit verfügt, zwischen niedrigen Fluoreszenzsignalen von Populationen und dem Instrumentenhintergrund zu unterscheiden (5). Die höhere Auflösung des DxFLEX-Durchflusszytometers bedeutet, dass es innerhalb einer gegebenen Probe schwach gefärbte Populationen effektiver von ungefärbten Populationen unterscheiden kann. 

Tabelle 3. Kombinierte Zentren: Übereinstimmung der qualitativen Ergebnisse

Tabelle

Tabelle 4. Zentrum 1: Übereinstimmung der qualitativen Ergebnisse

Tabelle 4

Tabelle 5. Zentrum 2: Übereinstimmung der qualitativen Ergebnisse

Tabelle 5

Die statistische Analyse für die Proben insgesamt (Tabelle 6) und für jedes einzelne Zentrum (Tabelle 7 und Tabelle 8) wurde zusammengefasst, woraus hervorgeht, dass die Leistung des DxFLEX-Durchflusszytometers die Akzeptanzkriterien der Studie erfüllt. Die PPA zur Klassifizierung der HLA-positiven (+) Übereinstimmung zwischen dem DxFLEX Durchflusszytometer und FC500 betrug 100,00 % für alle aufgenommenen Proben. Die NPA zur Klassifizierung der HLA-negativen (-) Übereinstimmung betrug 94,14 % für alle Proben zusammen. Die Gesamt-OPA für alle Proben lag bei 96,53 %. Darüber hinaus zeigten die statistischen Ergebnisse jedes Zentrums auch eine vergleichbare Leistung des DxFLEX im Vergleich zum FC500.

Tabelle 6. Leistungsübereinstimmung der kombinierten Zentren

Tabelle 6

Tabelle 7. Zentrum 1: Leistungsübereinstimmung

Tabelle 7

Tabelle 8. Zentrum 2: Leistungsübereinstimmung

Tabelle 8

Zusammenfassung

Das Durchflusszytometer DxFLEX zeigte seine insgesamt verbesserte Leistung, indem es die Akzeptanzkriterien auf der Grundlage seiner Leistungsübereinstimmung mit seinem Vorgänger-Instrument erfüllte. Zudem wurden die DxFLEX Daily QC Fluorospheres erfolgreich zur Überprüfung der täglichen Geräteleistung eingesetzt, die Laserverzögerung, Laserleistung, Verstärkung, MFI und rCV für alle dreizehn Fluoreszenzkanäle umfasste. 

Literaturhinweise

  1. Gülderen Yanıkkaya Demirel,1 Ömer Güze. Accurate and Simple Interpretation of HLA B27 Screening by Flow Cytometry. Turk J Turk J Immunol 2016;4(1):1-6
  2. Skalska U, Kozakiewicz A, Maslinski W, Jurkowska M. HLA-B27 detection - comparison of genetic sequence-based method and flow cytometry assay. Reumatologia. 2015;53(2):74-78.
  3. Albrecht J, Muller HA. HLA-B27 typing by use of flow cytofluorometry. Clin Chem. 1987;33(9):1619-1623.
  4. Lingenfelter B, Fuller TC, Hartung L, Hunter J, Wittwer C. HLA-B27 screening by flow cytometry. Cytometry. 1995;22(2):146-149.
  5. Wood J, Hoffman R, Evaluating Fluorescence Sensitivity on Flow Cytometers: An Overview. Wiley-Liss. 1998 33:256-259.
* Nur für Forschungszwecke vorgesehen. Nicht bei Diagnoseverfahren verwenden.
 

Vereinfachung der High-Complexity-Durchflusszytometrie

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