Dr. Andreas Böhmler, Director Strategic Marketing Clinical Solutions, Beckman Coulter Life Sciences, Krefeld, Germany

Typische unerfüllte Bedürfnisse

Einhaltung internationaler Leitlinien und Standards

Vor dem Hintergrund der zunehmenden Anwendung von mobilisierten hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC) für Transplantationszwecke beschrieben Sutherland et al. in Zusammenarbeit mit der International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) 1996 eine Reihe von Standards für die Zählung CD34-positiver Zellen. Ziel war die Entwicklung einer einfachen, empfindlichen Methode, die ein hohes Maß an Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zwischen den Laboren ermöglicht.Die daraus resultierende „ISHAGE-Leitlinie” entwickelte sich schnell zum Goldstandard für die Zählung CD34-positiver hämatopoetischer Vorläuferzellen mittels Durchflusszytometrie.¹ Im Jahr 1998 veröffentlichten Keeney et al. eine abgewandelte Version der Leitlinie von 1996. Darin führten sie Beads für die Absolutzählung ein, nahmen 7-AAD als Farbstoff für die Viabilitätsbestimmung hinzu, um tote Zellen auszuschließen, und verwendeten ein Lysereagenz ohne Fixativa.² Durch diese Änderungen wurde das Basisprotokoll in eine Ein-Plattform-Methode umgewandelt, und die daraus resultierende Leitlinie „Single platform with viability dye ISHAGE Guidelines“ ist auch über 20 Jahre danach noch weitgehend unverändert.

Die Besonderheit der ISHAGE-Leitlinie ist eine sequenzielle Gating-Strategie, welche die Zahl der CD34-positiven Zellen aus den vitalen Leukozyten ableitet. Die Leitlinie verlangt zudem, dass die Tests als Doppelbestimmung mit Negativkontrolle durchgeführt werden, um Testvariabilität und unspezifische Zell- und Fluorochrombindung zu korrigieren. Aufgrund der Selektivität des sequenziellen Gatings stuften die Autoren der ISHAGE-Leitlinie die Verwendung einer Negativkontrolle in späteren Jahren als optional ein, doch das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) fordert sie weiterhin.³ Im Gegensatz zu den ISHAGE-Leitlinien sind die im Ph. Eur. beschriebenen Standards rechtlich bindend, so wie es das Übereinkommen des Europarats über die Ausarbeitung eines Europäischen Arzneibuchs und die Arzneimittelgesetze der EU und der Mitgliedstaaten vorsehen.

Die derzeit als Bestandteil von IVD-Systemen erhältlichen Softwarelösungen bieten keine Möglichkeit, Panels für die CD34+-Zählung wahlweise mit oder ohne Negativkontrolle zu verwenden, ohne den IVD-Status zu verlieren. Außerdem enthalten nicht alle Reagenzien Kits zur Zählung von CD34-positiven Zellen eine Negativkontrolle.

Der Ausgangspunkt der sequenziellen Gating-Strategie nach ISHAGE, d. h. die vitalen Leukozyten, erleichtert zwar die korrekte quantitative Bestimmung seltener CD34-positiver Zellpopulationen erheblich, gleichzeitig bedeutet dies jedoch, dass letztlich alle gezählten CD34+-Zellen automatisch vital sind. Daher kann sich die Berechnung des Anteils der vitalen CD34+-Zellen an der Gesamtheit der CD34-positiven Zellen schwierig gestalten. Darüber hinaus kann es bei Anwendung der Gating-Strategie eine Herausforderung sein, die Gesamtzahl der CD45-positiven Leukozyten zu bestimmen, um die Probenviabilität insgesamt zu beurteilen.⁷

Im Fall von CD34-positiven Zellen aus Nabelschnurblut verlangt die kürzlich veröffentlichte 7. Ausgabe von ‘NetCord-FACT – Internationale Standards für die Entnahme, Lagerung und Anwendungsfreigabe von Nabelschnurblut’ die Bestimmung sowohl der CD34+-Gesamtzahl als auch der Gesamtzahl der vitalen CD34+-Zellen für die weitere Aufbereitung von Nabelschnurblut vor der Kryokonservierung sowie die Beurteilung des vitalen CD34+-Anteils vor der Freigabe einer Nabelschnurbluteinheit zur klinischen Anwendung⁴.

CD34+-Zählung zur Qualitätskontrolle (QK)

Wenn die quantitative Bestimmung von CD34-positiven Zellen zu QK-Zwecken erfolgt, benötigen Labore die Möglichkeit, anstelle des „vollen“ ISHAGE-Panels mit Doppelbestimmung plus Negativkontrolle lediglich eine Einzelbestimmung durchzuführen. Dies gilt insbesondere, wenn zur Analyse nur kleine Probenvolumen zur Verfügung stehen. Die bisherige Zählsoftware verfügt nicht über die Flexibilität, das Panel im Rahmen der IVD-Lösung entsprechend anzupassen. Für QK-Zwecke ist zwar nicht zwingend ein IVD-System erforderlich, doch die meisten Labore, die solche Tests durchführen, sind streng reguliert und sehen deshalb eher davon ab, einen separaten, selbst entwickelten Test allein zu diesem Zweck zu validieren.

Rückverfolgbarkeit von Proben und Reagenzien

Labore, die Zählungen von CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) durchführen, sind hinsichtlich der Datenrückverfolgbarkeit stark reguliert und müssen – vor allem, wenn sie sich akkreditieren lassen – ein umfassendes QK-System einrichten (6). Erforderlich sind unter anderem die folgenden Kontrollmechanismen:

• Vermeidung einer falschen Probenzuordnung während des gesamten Prozesses durch geeignete Kennzeichnung aller Proben
• geeignete Vorkehrungen zur Überwachung der Zuverlässigkeit, Richtigkeit, Präzision und Leistung von Testverfahren und Geräten
• Funktionsprüfungen von Geräten und Reagenzien
• Einsatz entsprechenden Referenzmaterials und Dokumentation der regelmäßigen Ringversuche
• Prozess zur Verhinderung, dass verfallene Reagenzien und Verbrauchsmaterialien eingesetzt werden
• Mechanismus zur Verknüpfung von Chargennummer, Verfallsdatum und Hersteller der Verbrauchsmaterialien und Reagenzien mit den einzelnen Proben

Die letzten beiden Punkte können eine besondere Schwierigkeit darstellen, da die Dokumentation der Reagenzien und der Proben oft nicht miteinander verknüpft ist und „offline“ geschieht, d. h. nicht auf der zur Datenerfassung und -analyse verwendeten Plattform.

Laborautomation

In hämato-onkologischen Laboren treffen HPC-Proben häufig als Notfallproben (STAT-Proben) ein und müssen sofort bearbeitet werden, was eine Unterbrechung der routinemäßigen Workflows bedeutet. Beim Auftreten von Problemen mit diesen Proben erhöht sich der Aufwand und somit das Potenzial für menschliche Fehler. Wünschenswert wäre es, HPC-Proben in diesen Laboren in den normalen Workflow zu integrieren. Dies sollte im Idealfall so geschehen, dass das Fehlerrisiko bei der Probennahme minimal ist, denn die Analyse von CD34-positiven HPC ist zeitkritisch. Labore, die sich auf die CD34+-Zählung spezialisiert haben, beispielsweise Einrichtungen zur Aufbereitung von Nabelschnurblut, würde ein höherer Automationsgrad helfen, die steigende Zahl der zu analysierenden Proben zu bewältigen und dabei weiterhin die oben beschriebenen hohen Anforderungen an die Rückverfolgbarkeit zu erfüllen.

Die derzeitigen IVD-Lösungen zur Zählung von CD34-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie lassen sich nicht automatisieren. Dies ist hauptsächlich dadurch bedingt, dass Erythrozyten-Lysereagenzien eingesetzt werden, die sich negativ auf die Zellvitalität auswirken, sodass die vorbereiteten Proben vor der Analyse auf Eis gelagert werden müssen. In der ISHAGE-Leitlinie wird der Einsatz von Ammoniumchlorid vorgeschlagen, weil dieses damals praktisch das einzige verfügbare Lysereagenz war, das für eine Lyse ohne Waschen geeignet war, ohne zusätzliche Fixativa zu erfordern oder die Streuungseigenschaften der interessierenden Zellpopulation zu verändern. Auch wenn die Verwendung von Ammoniumchlorid in praktisch allen handelsüblichen CD34+-Zählkits für die Durchflusszytometrie etabliert ist, verhindert sie die Durchführung von CD34+-Tests auf automatisierten Probenvorbereitungs- und Durchflusszytometrie-Plattformen, weil sie die Zellvitalität beeinflusst und die Arbeitslösung täglich frisch hergestellt werden muss.

Heute sind gebrauchsfertige Erythrozyten-Lysereagenzien erhältlich, die im Zuge der Probenvorbereitung spezifisch Erythrozyten lysieren, ohne die Vitalität der Leukozyten wesentlich zu beeinflussen. Damit kann die Zählung von CD34-positiven Zellen auch auf automatisierten Durchflusszytometriesystemen durchgeführt werden.

Weiterentwicklung des Goldstandards

Ein Kit der nächsten Generation zur durchflusszytometrischen quantitativen Bestimmung von CD34-positiven Zellen vereint die Vorteile etablierter Standards und Protokolle mit einer ausreichenden Flexibilität, Reagenzien und Software-Tools an den heutigen Bedarf eines klinischen Labors anzupassen. Hierzu gehören Erfassungs- und Analyse-Panels für unterschiedliche Laborerfordernisse, bei deren Verwendung keine eigenen Tests parallel zu IVD-Lösungen entwickelt werden müssen, Qualitätskontrollmechanismen, die den Anforderungen eines streng regulierten Arbeitsumfelds entsprechen, sowie ein hoher Automationsgrad (Abb. 1).

Abbildung 1. Merkmale einer Lösung zur Identifikation und quantitativen Bestimmung von CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen, welche die heutigen Anforderungen klinischer Labore erfüllt (basierend auf quantitativer Marktforschung)

AQUIOS STEM-System

Das AQUIOS STEM-System wurde gemeinsam mit führenden Experten auf dem Gebiet der klinischen CD34+-Zählung entwickelt, um den Goldstandard noch weiter zu verbessern. Es basiert auf einem modularen Konzept für die automatisierte Analyse von CD34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen auf dem AQUIOS CL-Durchflusszytometer (Tab. 1) und besteht aus den folgenden Komponenten:

• AQUIOS STEM-Software für das AQUIOS CL-Durchflusszytometrie-System,
• AQUIOS STEM-Kit-Reagenzien zur Zählung CD34-positiver Zellen,
• AQUIOS STEM CD34-Kontrollzellen (2 Konzentrationen).

Flexible Panels

Die AQUIOS STEM-Software stellt insgesamt drei verschiedene Erfassungspanels für die klinische Zählung CD34-positiver Zellen bereit (Abb. 2). Alle Protokolle folgen der sequenziellen Gating-Strategie der ISHAGE-Leitlinie und die Panels gestatten es, entweder das „volle“ Panel mit drei Tests (Doppelbestimmung plus Negativkontrolle), wie es von ISHAGE empfohlen und vom Ph. Eur. vorgeschrieben wird, das optionale ISHAGE-Panel ohne Negativkontrolle oder eine Einzelbestimmung durchzuführen. Letztere kann für QK-Zwecke bei seltenen Probentypen genutzt werden. Alle Panel-Kombinationen sind Teil der IVD-Lösungen, sodass sich laborentwickelte Tests erübrigen.

Abbildung 2. Paneloptionen des AQUIOS STEM-Systems zur klinischen quantitativen Bestimmung von CD34+-HPC.

Antikörper- und Reagenzlösungen

Die AQUIOS STEM-Kit-Reagenzien umfassen ein murines monoklonales CD45-FITC/CD34-PE-Antikörperreagenz, eine dazugehörige negative Kontrolle (CD45-FITC/CD34-CTRL), ein Absolutzahlreagenz (AQUIOS STEM-Count-Fluorosphären), ein Reagenz zur Bestimmung der Zellviabilität (7-AAD) und ein gebrauchsfertiges Lysereagenz. Die Reagenzmenge im Kit reicht für die Analyse von 50 Proben in Doppelbestimmung plus Negativkontrolle aus. Die Reagenzien für CD34 und CD45 enthalten die in der ISHAGE-Leitlinie empfohlenen Klone.

Eine Liste aller Bestandteile des AQUIOS STEM-Systems ist Tabelle 2 zu entnehmen, und Tabelle 3 bietet eine Übersicht über die Parameter und Probentypen, die mit dem AQUIOS STEM-System analysiert werden können.

Automationskonzept

Das AQUIOS CL-Durchflusszytometrie-System rationalisiert die Arbeitsabläufe, da es automatisierte Beladung, Probenvorbereitung, Reagenzverwaltung und Barcode-Erfassung mit Datenanalyse und bidirektionaler Anbindung an Laborinformationssysteme (LIS) in einem kompakten Gerät vereint. Wir nennen dieses Konzept „Load & Go Flow Cytometry“.

Mit der AQUIOS STEM-Software kann das bestehende AQUIOS CL-Anwendungsportfolio um die Zählung CD34-positiver Zellen erweitert werden, sodass sich die meisten Prozessschritte automatisieren lassen. Ermöglicht wird dies durch den Einsatz eines Erythrozyten-Lysereagenzes, das die Kriterien der ISHAGE-Leitlinie erfüllt (kein Waschen, keine Zugabe von Fixativa, keine Veränderung der Streuungseigenschaften der Zielpopulation), jedoch bei Raumtemperatur gelagert und gehandhabt werden kann, als gebrauchsfertiges Produkt das tägliche Ansetzen einer Arbeitslösung aus Stammlösungen überflüssig macht und schonend für die interessierenden Populationen ist.

Die zur Absolutzählung verwendete Bead-Lösung besitzt einen sorgfältig austarierten Auftrieb, sodass sie nicht vor jedem einzelnen Pipettierschritt neu gemischt werden muss. Zusätzlich ist der Behälter der Beads mit einem speziellen Verschluss ausgestattet, der Verdunstung entgegenwirkt.

Die Proben werden entweder über den Kassetten-Autoloader des AQUIOS CL oder den Einzelröhrchen-Lader für STAT-Proben geladen. Im letzteren Fall erhalten sie Vorrang vor den anderen Proben in der Warteschlange. So wird ein nahtloser Workflow ohne Unterbrechung laufender Vorgänge sichergestellt. Die Probenvorbereitung erfolgt in Deep-Well-Platten mit 96 Wells unter Verwendung von separaten Nadeln für die Probenvorbereitung und die Analyse. Dadurch finden beide Schritte parallel statt und die Proben werden analysiert, sobald die Probenvorbereitung abgeschlossen ist.

Abbildung 3. Der Autoloader eignet sich für diverse Röhrchengrößen, bietet Platz für bis zu 40 Proben und gestattet Laden und Entladen in beliebiger Reihenfolge. Das System verfügt über einen eingebauten Barcodescanner zur eindeutigen Rückverfolgung der Autoloader-Proben. Die Proben-ID wird dem Auftrag zugeordnet und die Patientendaten stehen während des Probenprozesses jederzeit sofort zur Verfügung. Für STAT-Proben, Proben in offenen Röhrchen oder ungewöhnliche Röhrchengrößen ist ein separater Einzelröhrchen-Lader verfügbar.

Das AQUIOS CL kann ohne Bedenken von Personen bedient werden, die nicht speziell für die Durchflusszytometrie ausgebildet sind, sodass Mitarbeiter so eingesetzt werden können, dass eine maximale Produktivität erzielt wird.

Qualitätskontrollmechanismen

Mit Barcodes versehene Reagenzien. Die AQUIOS-Reagenzien sind mit einem eindeutigen Barcode gekennzeichnet, der die Überwachung bzw. Rückverfolgung von Verfallsdatum, Haltbarkeit im Gerät, Chargen- und Behälternummern ermöglicht. Reagenzverbrauch und Plattennutzung werden vom System während der Probenverarbeitung überwacht. Der Barcodescanner liest Reagenzien und Platten beim ersten Gebrauch ein, um sicherzustellen, dass die Verbrauchsmaterialdaten fehlerfrei sind. Das Reagenzüberwachungssystem AQUIOS Smart-Track ermöglicht die Überwachung von Verbrauchsmaterialien in Echtzeit, um sicherzustellen, dass keine verfallenen Reagenzien verwendet werden und ausreichend Reagenz für jede Probe vorhanden ist. Damit entfällt das Risiko, dass Proben erneut getestet werden müssen, weil das Reagenzvolumen nicht ausreicht. Das System führt einen Test nur dann aus, wenn die erforderlichen Antikörperfläschchen vorhanden sind.

Proben-Barcodes und eindeutige Proben-ID. Der Barcodescanner des AQUIOS CL für Röhrchen kann Proben-Barcodes automatisch lesen. Ein Barcodeleser als Handgerät wird nicht benötigt. Das AQUIOS CL-Durchflusszytometer gleicht die Barcode-Daten des Röhrchens mit dem LIS-Auftrag ab. Die Proben-ID wird unmittelbar vor der Probenaspiration erfasst, um Falschzuordnungen zu verhindern, und wird während des gesamten Laufs automatisch verfolgt.

Prozesskontrollen. Bei den AQUIOS STEM CD34-Kontrollzellen handelt es sich um Flüssigpräparate stabilisierter humaner Leukozyten, die im Rahmen des AQUIOS STEM-Systems zur Überprüfung der Parameter CD34 und CD45 eingesetzt werden. Jedes Kit enthält CD34 in zwei Konzentrationen, mit ungefähr 10 CD34+ Zellen/µl (Level 1) und ungefähr 30 CD34+ Zellen/µl (Level 2). Die Assaywerte werden durch Scannen des auf dem Kontrollzellen-Assayblatt aufgedruckten Barcodes im System erfasst.

Das QK-Modul der AQUIOS STEM-Software bietet Zugang zu eIQAP (electronic Interlaboratory Quality Assurance Program), dem Programm von Beckman Coulter zur elektronischen laborübergreifenden Qualitätssicherung. Mit diesem Programm können Laboranwender Berichte über Peergroup-Vergleiche ihrer Qualitätskontrolldaten erstellen.

Automatische Pausierung bei fehlgeschlagener QK. Das AQUIOS CL-Durchflusszytometer ist als Load-and-Go-Gerät konzipiert und besitzt eine integrierte automatische Pausenfunktion. Wenn diese vom Anwender aktiviert wird, wird die Verarbeitung der Patientenproben automatisch fortgesetzt, sobald die QK bestanden wurde. Ist die Funktion aktiviert und die QK schlägt fehl, verarbeitet das Gerät keine Patientenproben und der Anwender kann automatisch benachrichtigt werden.

Systemprüfungen. Das System überprüft vor der Testung jeder Probe, ob die Laserleistung und das Vakuum im Toleranzbereich liegen. Es überprüft zudem die interne Datenübertragung sowie die ordnungsgemäße Funktion der Hardware bei jedem Schritt des Prozesses. Darüber hinaus führt das System zu Beginn jedes Laufs eine Überprüfung des Flüssigkeitssystems durch, um sicherzustellen, dass genügend AQUIOS-Mantellösung für den angeforderten Lauf vorhanden ist.

Erweiterte Berichtsoptionen

Zur Unterstützung interner und externen Standards und Anforderungen der Qualitätskontrolle gibt die AQUIOS STEM-Software mehrere statistische Parameter aus, die über den Umfang üblicher durchflusszytometrischer Berichte zur quantitativen Bestimmung CD34-positiver Zellen hinausgehen (Tab. 1). Eine vollständige Liste der Parameter ist dem Anwendungsbulletin „Arbeiten mit dem AQUIOS STEM-System auf der Grundlage internationaler Leitlinien zur klinischen Zählung CD34-positiver hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen“ zu entnehmen.

Tabelle 1. Ausgewählte Statistik- und Populationsparameter des AQUIOS STEM-Systems, die über den Umfang üblicher durchflusszytometrischer Berichte zur quantitativen Bestimmung CD34-positiver Zellen hinausgehen und die Einhaltung von internen und externen Standards und Anforderungen der Qualitätskontrolle unterstützen.

Komponenten und Parameter des AQUIOS STEM-Systems

Das AQUIOS STEM-System basiert auf einem modularen Konzept für die automatisierte Analyse von CD34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen auf dem AQUIOS CL-Durchflusszytometer: Die Lösung besteht aus den in Tabelle 2 aufgeführten Komponenten und ist zur Verwendung durch Laborfachkräfte zum Nachweis der Parameter in den in Tabelle 3 genannten Probentypen auf dem automatisierten AQUIOS CL-Durchflusszytometer bestimmt.

Tabelle 2. Ausgewählte Statistik- und Populationsparameter des AQUIOS STEM-Systems, die über den Umfang üblicher durchflusszytometrischer Berichte zur quantitativen Bestimmung CD34-positiver Zellen hinausgehen und die Einhaltung von internen und externen Standards und Anforderungen der Qualitätskontrolle unterstützen.

Tabelle 3. Parameter des AQUIOS STEM-Systems

Quellen

1. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I: The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother. 1996 Jun;5(3):213-26.
2. Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR: Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):61-70.
3. EDQM Council of Europe: European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). 10th Edition 2019-2022. Website: https://pheur.edqm.eu/home
4. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT): NetCord-FACT international standards for cord blood collection, banking, and release for administration. 7^th Edition, 2019. Website: http://www.factwebsite.org/
5. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT) - Joint Accreditation Committee (JACIE): FACT-JACIE International standards for hematopoietic cellular therapy product collection, processing, and administration. 8^th Edition, 2021. Website: http://www.factwebsite.org/
6. Dorn-Beineke A, Sack U: Quality control and validation in flow cytometry. J Lab Med 2016; 40 s1:1-13.
7. Whitby A, Whitby L, Fletcher M, Reilly JT, Sutherland DR, Keeney M, Barnett D: ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Cytometry B Clin Cytom. 2012 Jan;82B:9-17.