Überlegungen zur Zellzählung beim Gebrauch von verschiedenen Zelltypen

Beckman Coulter Life Sciences freut sich, Ihnen den neuen Vi–CELL BLU Zellvitalitätsanalysator vorzustellen. Der Vi–CELL BLU baut auf den zentralen Leistungsmerkmale des Vi–CELL XR auf, wurde aber um viele Designverbesserungen ergänzt, die sich unsere Kunden im Laufe der Jahre gewünscht haben.

Die automatische Zellzählung erscheint auf den ersten Blick als einfaches Unterfangen, wird jedoch von verschiedenen Bedingungen und Variablen beeinfl usst, die sowohl mit der Probe als auch mit dem Gerät zusammenhängen. Mit dem neuen Vi–CELLBLU haben wir die Möglichkeit gescha en, 96Pr oben in eine Standardplatte zu laden und als einen einzigen Versuch zu bearbeiten. Dies nimmt jedoch rund 3 Stunden in Anspruch, was insbesondere bei Zelltypen, die generell eine geringe Vitalität aufweisen oder außerhalb des Inkubators oder Bioreaktors schnell absterben, ungünstig ist.

Der Plateloader bietet auch die Möglichkeit, in einem Lauf mehrere unterschiedliche Versuchs-bedingungen anzuwenden, und ermöglicht damit die Auswertung verschiedener Bedingungen oder Kriterien.

Zum Nachweis dieser Fähigkeiten haben wir mehrere verschiedene Zelltypen und Zellvorbereitungsmethoden unter Verwendung von Standardzellen untersucht.

Vi CELL BLU side load image

Abbildung 1: Vi–CELLBLU Zellvitalitätsanalysator

Analyse der Zellzählung

Zur Bewertung der Auswirkungen langer Analysezeiten und unterschiedlicher Probenvorbereitungsbedingungen auf verschiedene Zelltypen wurden Kulturen von CHO (Chinese Hamster Ovary), EL4 (murine T-Lymphom-Zelllinie), SF9-Insektenzellen (Ovargewebe von Spodoptera frugiperda) und HeLa-Zellen verwendet.

Einfl uss der CHO-Zellprobenvorbereitung

Zentrifugation und Resuspension sind Routinemethoden zur Aufreinigung und Konzentration von Zellen vor dem erneuten Beimpfen oder der Verwendung in weiteren Versuchen. CHO-Zellen gelten im Allgemeinen als recht widerstandsfähig, stellen jedoch besondere Ansprüche an die Wachstumsbedingungen und erfordern spezielle Medien, damit ein bestmöglicher Gesundheitszustand aufrechterhalten wird. Im unten beschriebenen Versuch wurden die Zellen relativ schonend 5 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert, bevor sie in Medium oder Puffer resuspendiert wurden, um einen etwaigen Einfl uss der Zellvorbereitung auf die Zellgesundheit zu beurteilen.

Ergebnisse

Vorbereitung Konzentration
(Mio./ml)
Vitalität
(%)
Durchmesser
(μm)
Ohne Vorbereitung 4.83 94.30 16.12
1 Zentrifugiervorgang,
Resuspension in Medium
5.05 94.48 16.17
1 Zentrifugiervorgang,
Resuspension in PBS
4.70 65.69 14.17
2 Zentrifugiervorgänge,
Resuspension in PBS
4.45 53.77 13.99

Die Ergebnisse zeigen, dass Zentrifugation und Resuspension im empfohlenen Medium keinen nennenswerten Einfl uss auf die CHO-Zellen haben. Eine Resuspension in PBS-Puffer führt dagegen zu einem drastischen Vitalitätsverlust und einer erheblichen Abnahme des durchschnittlichen Zelldurchmessers. Es kommt auch zu einer geringfügigen Verringerung der Zellkonzentration, die aufgrund von Verlusten bei der Resuspension erwartbar ist. Eine zweite Zentrifugation und Resuspension in PBS hat weitere negative Auswirkungen auf Vitalität und Größe der Zellen.

Abbildung 2: Einfl uss der Probenvorbereitungsmethode auf CHO-Zellen

Analyse der Mischzyklen bei EL4-Zellen

EL4-Zellen gelten im Allgemeinen als empfi ndlich; sie wachsen selbst unter Idealbedingungen langsam und weisen eine Vitalität von unter 70% auf. EL4-Zellen wurden vorbereitet und in eine Mikrotiterplatte gegeben. Ausgehend vom Säuger-Standardzellprofil wurden Zelltyp-Profile mit unterschiedlichen Mischzyklen erstellt. Zielsetzung war es, einen etwaigen Einfl uss einer stärkeren Bewegung auf einen Zelltyp zu beurteilen, der bekanntermaßen durch Vortexen und Zentrifugieren leicht zerstörbar ist.

Ergebnisse

Die Ergebnisse für die EL4-Zellen sind nachstehend aufgeführt.

Mischzyklen Zellzahl Zahl der vitalen Zellen Konzentration (Mio./ml) Vitalität (%) Durchmesser (µm)
1 4648 2837 1.72 61.06 11.34
3 4637 2715 1.72 58.54 11.34
5 4660 2582 1.73 55.69 11.34
7 4660 2448 1.73 52.53 11.32

Während Zellzahlen sowie Konzentrations- und Durchmesserwerte keine Veränderungen von statistischer Signifi kanz aufweisen, ist eine starke Abnahme der Zahl der lebensfähigen Zellen und somit der Zellvitalität mit zunehmender Zahl der Mischzyklen bei allen Verdünnungen zu erkennen. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass ein Zelltyp-Profil mit weniger Aspirations- und Mischzyklen für diese Art von Zellen besser geeignet sein könnte und eine übermäßige Bewegung ungünstig und nach Möglichkeit zu vermeiden ist.

Abbildung 3: Einfl uss von Mischzyklen auf EL4-Zellen

SF9-Insektenzellen

SF9-Zellen erreichen selbst bei Züchtung unter Idealbedingungen nur schwer eine hohe Dichte und zeigen typischerweise eine Vitalität von unter 60%. Daher könnte sich die längere Zeit im Gerät, die für eine Plattenbearbeitung benötigt wird, negativ auf die Zellkultur auswirken. Zur Beurteilung wurden diese SF9-Zellen auf eine Platte gegeben und mit dem Insekten-Standardzellprofil analysiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass es im Verlauf des 3-stündigen Laufs weder erkennbare Auswirkungen auf die Zellvitalität noch eine nennenswerte Veränderung des Zelldurchmessers gab, wie sie beim Absterben oder Anschwellen von Zellen auftreten können. Daraus lässt sich schließen, dass diese Zelllinie trotz ihrer geringen Vitalität robust genug ist, um längere Zeiten außerhalb der Zellinkubatorumgebung ohne negative Auswirkungen zu überstehen.

Abbildung 4: Vitalität und durchschnittlicher Durchmesser von SF9-Zellen im zeitlichen Verlauf. Im Verlauf des Versuchs wurde keine signifi kante Veränderung beobachtet.

HeLa-Zellkulturen

HeLa-Zellen wurden auf einen hohen Grad von Konfl uenz gezüchtet, um die Zellen zu belasten. Danach wurden die Zellen geerntet und in Suspension gebracht. Die Zellen wurden in eine Mikrotiterplatte gegeben und die Daten mit dem Mamallian-Standardzellprofil erfasst. Bei der Analyse der Platten wurden die Daten spaltenweise erfasst, um sicherzustellen, dass zwischen den Proben in den Reihen jeweils derselbe Zeitabstand lag.

Es wurde festgestellt, dass die später in dem Lauf analysierten Proben geringfügig höhere Konzentrationen aufwiesen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass der durchschnittliche Durchmesser der Zellen mit der Zeit zunahm.

Abbildung 5: Prozentuale Zunahme des durchschnittlichen Durchmessers der HeLa-Zellen im zeitlichen Verlauf

Die aufgenommenen Bilder zeigen eine zunehmende Anzahl von anschwellenden oder Blasen bildenden Zellen sowie eine große Zahl nichtzellulärer Vesikel. Während sich letztere normalerweise nicht auf die Zellzahl auswirken, könnten sie je nach Zellprofi l auch als kleine Zellen gezählt werden. Der Schwelle- effekt bewirkt, dass der durchschnittliche Zelldurchmesser im Lauf der 3 Stunden, welche die Plattenbearbeitung in Anspruch nimmt, um fast 10 % zunimmt. Dies kann dazu führen, dass kleinere Zellen mit einem Durchmesser knapp unterhalb des unteren Grenzwerts in die Zellzahl eingehen.

Abbildung 6: Anschwellen und Blasenbildung von HeLa-Zellen nach >2 Std. außerhalb des Inkubators

Schlussfolgerungen

Es wird empfohlen, vor der Analyse einer Zellkultur auf einer vollständigen Platte zunächst eine Bewertung durchzuführen, um zu bestimmen, wie robust die betre enden Zellen sind und wie gut sie die Probenvorbereitungsmethoden und einen längeren Aufenthalt außerhalb der Inkubatorumgebung tolerieren. Selbst gentechnisch veränderte Zellen wie CHO-Zellen oder unsterbliche HeLa-Zellen, die im Allgemeinen wegen ihrer Widerstandsfähigkeit gewählt werden, können durch Belastungen oder bestimmte Probenvorbereitungsbedingungen beeinfl usst werden.

Helpful Links