Sieben Tipps zum Erstellen der perfekten Panel bei der Mehrfarben-Durchflusszytometrie

Mit gut konzipierten Panels und hochwertigen Reagenzien bietet die Mehrfarben-Durchflusszytometrie ein leistungsstarkes Werkzeug zur Detektion und Überwachung mehrerer Parameter Ihrer Probe zur gleichen Zeit.  Die Qualität der Daten hängt jedoch stark von einem optimierten Panel Design sowie von korrekt abgestimmten Geräten ab.  Diese sieben Tipps helfen Ihnen bei der Verbesserung der Qualität Ihrer Durchflusszytometriedaten und der Vermeidung häufiger Probleme bei der Mehrfarben-Durchflusszytometrie.

1. Fluorochrom-Auswahl

Nicht alle Farbstoffe sind gleich!  Einige Farbstoffe sind extrem hell, während andere im Vergleich verschwindend dunkel sind.  Die Auswahl der hellsten Farbstoffe ist jedoch nicht immer die beste  Idee und das Vermeiden von dunkleren Farben ist ebenfalls nicht immer ratsam. Grundsätzlich ist es ratsam einen Farbstoff zu verwenden, der ausreichend hell ist, um das Antigen nachzuweisen, während möglichst wenig Spillover oder Streuung in andere Detektoren verursacht werden. Spillovers treten auf, wenn das Emissionsspektrum eines Fluorochroms von einem Detektorsatz zur Messung der Emission eines anderen Fluorochroms erkannt wird und somit zu einem unerwünschten Signal im Kanal des zweiten Fluorochroms beiträgt. Eine hellere Emission führt zu einem höheren Potenzial für Spillover und gestreuteren Daten, was zu einem Verlust der Auflösung führen kann. Um das zu vermeiden sollten hellere Farbstoffe für schwach exprimierte Antigene und entsprechende dunklere Farbstoffe für stark exprimierte Antigene verwendet werden. Eine Befolgung dieser Regel ermöglicht das Demokratisieren Ihrer Farbstoffe!



2. Kanalauswahl

Spillover kann natürlich immer auftreten, aber Sie können Ihre Auswahl an Farbstoffen für Ihr Panel dennoch optimieren – Verwenden Sie Fluorochrome mit geringem Einfluss auf andere Kanäle für stark exprimierte Antigene (grüne Spalten), während Sie die schwächer exprimierten Antigene den Fluorochromen zuweisen, deren Detektionskanal nur geringfügig durch Spillover von anderen Fluorochromen betroffen ist (gelbe Zeilen). Ob ein Fluorochrom in eine der beiden oberen Kategorien fällt, hängt von der Gerätekonfiguration und der Auswahl der Fluorochromen ab. Testen Sie Fluorochrom- und Kanalkombinationen, um die beste Anordnung für Ihr Panel zu ermitteln.  

Beim Design von Experimenten, die alle verfügbaren Kanäle verwenden, ist es schwierig ein Spillover zu vermeiden, aber die folgenden Tipps können Ihnen helfen, die Auswirkungen einzudämmen, die ein Spillover auf Ihr Panel und die resultierenden Daten haben könnte.  



3. Antigenausschluss

Was ist schon ein bisschen Spillover bei gegenseitig ausschließenden Antigenen?  Spillover zwischen den Emissionsspektren von zwei Antigenen wird keine Auswirkungen auf Ihr Panel haben, wenn die Antigene nicht gemeinsam auf den gleichen Zellen im betroffenen Zellen-Gate exprimiert sind.



4. Antigen-Co-Exprimierung

Wenn ein Marker typischerweise oder potenziell eine modulierte oder schwache Exprimierungsdichte hat, sollten Sie versuchen, das Spillover von co-exprimierten Antigenen der Fluorochrom-Marker in diesen Marker-Kanal zu reduzieren, da ein Spillover Ihre Daten stören und potenzielle Modulationen maskieren kann. Nur ein Spillover von nicht co-exprimierten Antigenen von Fluorochrom-Marker ist sicher und wirkt sich nicht auf die Empfindlichkeit und Auflösung von modulierten oder schwach exprimierten Antigenen aus. 




5. Übergeordnet – Untergeordnet

Den eigenen Eltern wiedersprechen ist nicht immer eine schlechte Idee?  Bei Mehrfarben-Durchflusszytometrietestserien können Kinder, die ihren Eltern wiedersprechen, die Empfindlichkeit zwischen Markern aufrechterhalten.  Das heißt: Sie können ein Spillover von einem Untergruppen- oder Teilpopulationsmarker (untergeordneter Marker) oder einen Crosstalk mit dem Gating-Marker (übergeordneter Marker) zulassen.  Der übergeordnete Marker wird dieses Spillover tolerieren, da der untergeordnete Marker immer positiv für den übergeordneten Marker sein wird.  Wenn CD4 beispielsweise ein starkes Spillover im CD3-Kanal innerhalb eines Lymphozyten-Gates aufweist, wird die Leerwertverteilung nicht zu einer Leerwertverteilung im CD3-Kanal führen, da die CD4+ T-Zellen ebenfalls CD3+ sind.  Achten Sie auf gegenteilige Konditionen, wenn der übergeordnete Marker einen Crosstalk mit dem untergeordneten Marker hat, da das Signal des Spillovers des übergeordneten Markers den Leerwert des untergeordneten Signals kontaminieren wird. 



6. Positiver Schwellenwert

Ein Spillover zu einem co-exprimierten Antigen ist zulässig, wenn das Ziel lediglich in der Identifizierung von hell positiven Zellen oder in der Unterscheidung zwischen einer hellen und mittleren/dunklen Exprimierung liegt. Ein Spillover kann jedoch nicht toleriert werden, wenn das Ziel nur in der Unterscheidung zwischen einer dunklen und negativen Exprimierung liegt, da dies unsere Daten und Schlussfolgerungen trüben und zu Falsch-Positiv-Ergebnissen führen würde. 



7. Spillover-Komplexität

Verabschieden Sie sich von Komplexität und halten Sie die Spillover-Muster möglichst einfach und unkompliziert, um Phänotyp-abhängige Detektionsgrenzen zu vermeiden.  Denken Sie daran, dass es zu Spillover und der Verteilung von Fluorochromen kommen kann, die nicht in Ihrem Punktplot gezeigt sind, sodass ein „einfacher Ansatz“ manchmal ganz schön kompliziert sein kann!
 




Beachten Sie diese 7 Tipps bei der Planung Ihres nächsten Mehrfarben-Durchflusszytometrie-Assays, um bei Ihrem Panel eine optimale Signaldetektion und erhöhte Gewissheit der Ergebnisse bei verringerter Komplexität zu erzielen. Um Ihre Erfolgschancen mit der Mehrfarben-Durchflusszytometrie weiter zu steigern, sollten Sie hochwertige und robuste Reagenzien verwenden, die die Prüfung von aufsichtsführenden Behörden und Herstellungsstandards unterlaufen haben. 

Umso zuverlässiger Ihre Reagenzien, umso zuverlässiger Ihre Daten!
 

Dokumentation zur Immunophänotypisierung und verwandtes Material

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