Wie Sie den Arbeitsablauf der Exosom-Isolierung durch Automatisierung verbessern

Die differentielle Ultrazentrifugation wurde aufgrund ihrer hohen Anpassungsfähigkeit und der besonders reinen exosomalen Fraktionen, die sie hervorbringt, als Goldstandard in der Exosom-Isolierung beschrieben.1 Eine Automatisierung der mehrstufigen Arbeitsabläufe der Isolierung und Charakterisierung kann die Geschwindigkeit und Präzision bei gleichzeitiger Minimierung der Eingreifzeit und Variabilität zwischen den Durchgängen erhöhen. Trotz der scheinbar einfachen Voraussetzungen – mehrere Zentrifugenläufe mit mehreren Geschwindigkeiten – weist der Arbeitsablauf zahlreiche Schritte auf, deren Standardisierung mit manuellen Methoden kompliziert sein kann.  Zur Verbesserung des Qualität Ihrer isolierten Exosomen und jeglicher, daraus hergeleiteter Daten, gewährleistet die Automatisierung eine bessere Reproduzierbarkeit, Rückverfolgbarkeit und Präzision. Lernen Sie, wie die Automatisierung eine tiefer gehende Analyse, erhöhte Downstream-Flexibilität und genauere Identifizierung geringfügiger Änderungen der Exosom-Fraktionen ermöglichen kann.  

Zellwachstum bis zur Log-Phase

Hinweis: Ist Ihr Ausgangsmaterial eine Bioflüssigkeit von einer Flüssigbiopsie, so können Sie diesen Hinweis überspringen. 
In den meisten Labors ist das Zellwachstum bis zur Log-Phase eine Selbstverständlichkeit. Man benötigt lediglich etwas mehr Zeit und ein Hämozytometer. Es ist also nicht das Wachsen lassen von Zellen bis zur Log-Phase, das zusätzliche Aufmerksamkeit erfordert, sondern das Ausplattieren von Zellen vor dem Wachsen bis zur Log-Phase. Häufig kann die mittels Hämozytometer erzielte Zellzählung trotz der besten Bemühungen eines Wissenschaftlers aufgrund zahlreicher Variablen, darunter Aggregation, eine inhomogene Mischung und fehlerhafte Kalkulationfehlerbehaftet  sein. Damit Fehler in der Zelldichte Ihre Exosom-Isolierung nicht gleich zu Anfang verfälschen, können zuverlässige Zellzähler  und die Automatisierung der Zellaussaat die Genauigkeit und Standardisierung bieten, die in der täglichen, manuellen Laborarbeit gelegentlich fehlen.

Eine zu hohe oder zu geringe Zellaussaat erfordert ein umsichtiges Monitoring mittels Spektralphotometrie, um das Wachstum bis zur Log-Phase nicht zu verpassen.  Platten, auf die zur gleichen Zeit ungenau gezählte Zellen gesät werden, sind unter Umständen nicht zur gleichen Zeit für die Exosom-Ernte bereit. Mit einer prognostizierbaren Dichte gesäte Zellen sollten die Log-Phase zu einem prognostizierbarem Zeitpunkt erreichen, sodass der Zeitplan Ihres Assays eingehalten wird. Beim Umgang mit adhärenten Säugerzellen werden typischerweise mehrere Kulturen nebeneinander zum Wachsen gebracht. Dadurch ist die Beurteilung der Wachstumsphase mittels Spektralphotometer ohne Disruption der Experimentalzellen möglich. Neben den offensichtlichen Vorteilen einer Standardisierung Ihrer Zellaussaatmethode kann das Wissen um die typischen Wachstumsattribute Ihrer Zellen dazu beitragen, Probleme mit Ihren Zellen oder den Kulturbedingungen zu erkennen. Wenn Ihre Zellen typischerweise innerhalb von 18 Stunden eine Konfluenz erreichen, sie jedoch zu langsam oder zu schnell wachsen, ist es unter Umständen Zeit, ein neues Zellaliquot zu charakterisieren oder dies weist auf eine Änderung der Medienkomponenten oder Inkubationsbedingungen hin.  

HINWEIS: Die folgende Frage scheint als stilisierte TEXTBOX auf Seite

Warum ist das Log-Phasen-Wachstum bei der Exosomernte von Bedeutung? Da Exosomen der gewünschte Endpunkt sind, können die Bedingungen, unter denen Zellen wachsen – und unter denen Exosomen ausgeschieden werden – direkten Einfluss auf die Qualität der Exosomen und den Wert ihrer Frachten haben. Zum Beispiel weisen Zellen, die unter stressigen Bedingungen gewachsen sind – ähnlich jenen, die man bei zu hoher Konzentration findet – eine Verschiebung der Exosom-Fraktionen auf, welche die rauere Umgebung widerspiegelt.2 Wenn das Ziel Ihres Versuchs die Rekapitulation der Exosom-Fraktionen von normalen Bedingungen ist, so ist die Sicherstellung, dass Ihre Exosomen zum richtigen Zeitpunkt geerntet wurden, von Bedeutung.

Für eine exakte Ultrazentrifugation müssen Sie Ihren Rotor kennen

Der Weg zur Nutzung einer Ultrazentrifuge kann einschüchternd sein. Sie ist ein teures Gerät und wir alle haben die Horrorgeschichten von Personen gehört, die die falschen Röhrchen verwendet oder U/min-RZB-g falsch umgerechnet und das Gerät beschädigt haben, ganz zu schweigen von dem Verlust ihrer schwer gewonnenen Proben. Ultrazentrifugation erfordert einen hohen Grad an Präzision, nicht nur bei der Präparation von Proben, sondern auch bei der Auswahl des richtigen Rotors für die Aufgaben. Die Wahl eines Rotors mit einem niedrigen k-Faktor, der auf einer Berechnung aus der Winkelgeschwindigkeit der Zentrifuge und den Radien des Rotors beruht, gewährleistet die effizienteste differentielle Zentrifugation Ihrer Proben.1 Zum Beispiel weist ein Ausschwingrrotor eine höhere Differenz zwischen dem minimalen und maximalen Radius als ein Festwinkelrotor auf. Das heißt, dass sich identische Proben in einem Festwinkelrotor schneller klären, was zu einer genaueren Trennung von Partikeln innerhalb des Dichtegradienten gemäß ihrem isopyknischen Punkt führt als mit einem Schwingbecherrotor. Berücksichtigen Sie, dass k-Faktoren sich auf einen bestimmten Rotor beziehen, der in einer bestimmten Zentrifuge verwendet wird, und dass sie für jede Rotor-/Zentrifugen-Kombination neu berechnet werden müssen. Geschwindigkeit ist eine zweite Variable, die zu berücksichtigen ist, und sie hängt vom verwendeten Rotor und von den ausgewählten Einstellungen ab. Die Sicherstellung, dass Ihre Proben für die richtige Dauer mit der richtigen Geschwindigkeit zentrifugiert werden, ist für den Erfolg Ihrer Exosom-Isolierung mit differentieller Ultrazentrifugation entscheidend. Zur Minimierung der Wahrscheinlichkeit, dass Ihre Proben durch Verwendung eines falschen Rotors nicht adäquat pelletiert werden, vertrauen Sie mit dem Beckman Rotorkalkulator auf Ihre Rotorauswahl.

Automatisierte Herstellung  des Dichtegradienten

Dichtegradienten sind für die Reinheit isolierter Exosomen entscheidend, da sie den Dichteunterschied zwischen Exosomen und anderen, ähnlich großen Partikeln, wie Viren und kleine, apoptotische Körperchen nutzen, um sie zuverlässig voneinander zu trennen. Herkömmliche Dichtegradienten wurden mit immer stärker konzentrierten Saccharoselösungen aufgebaut, doch neuere Protokolle haben die Verwendung eines Iodixanolgradienten für eine bessere Trennung und isoosmotische Konservierung der Exosomgröße erforderlich gemacht. Andere Methoden zur Isolierung von Exosomen werden häufig vorgeschlagen, doch bisher hat keine die Ultrazentrifugation über den Dichtegradienten bezüglich der Exosomreinheit und Frachtenvielfalt geschlagen.3 Da der Dichtegradient für die Reinheit ultrazentrifugal präparierter Exosomen von zentraler Bedeutung ist, muss die genaue Präparation der Komponentenlösungen sowie die präzise Gradientenschichtung sichergestellt werden. Zu diesen Zwecken ist die automatisierte Herstellung des Dichtegradienten mittels Liquid Handlers ideal geeignet. Ein Liquid Handler kann die Iodixanol-/Saccharoselösungen sorgfältig schichten und so einen diskontinuierlichen Dichtegradienten bilden. 

Bestimmung der Exosomgröße und -konzentration
Nach der Isolierung können die einzelnen Exosom-Fraktionen auf ihre Frachten (Proteine, Lipide, Nukleinsäuren, usw.) direkt analysiert bzw. charakterisiert werden. Ein üblicher Charakterisierungsschritt, der automatisiert werden kann, ist die Exosomgrößenanalyse, die auf dem Nanopartikel-Tracking beruht, um sowohl die Größenverteilung als auch die Konzentration der Exosomen im Verdünnungsmittel zu identifizieren. Eine Gerät für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) kann problemlos in die vollständige Exosom-Isolierung und -Charakterisierung integriert werden. Dieses ermöglicht eine genaue und reproduzierbare Bestimmung der Exosomgröße und -konzentration. 

Vereinfachung der Downstream-Analyse

In den meisten Fällen ist das ultimative Ziel der Exosom-Isolierung nicht die einfache Zusammentragung von Exosomen, sondern die Untersuchung ihrer Frachten als Hilfsmittel zum Verständnis dieser seit neuestem geschätzten Form der interzellulären Kommunikation. Wissenschaftler haben erfolgreich DNA,4 RNA,5, 6 und Protein7, 8 von Exosomen isoliert und haben sie zur Analyse der Schlüsselkomponenten und Auswirkungen der kleinen Botschafter verwendet. Einige dieser Analysen, wie z. B. RNA-seq, erfordern sorgfältig und reproduzierbar aufgebaute Reaktionen, was mit der automatisierten Workstation erreicht werden kann, während andere, wie z. B. ELISAs, Plattenpräparation und -inkubation sowie Plattenauslesefähigkeiten erfordern. Sie alle können in einen nahtlosen Arbeitsablauf mit smarter, flexibler Automatisierung programmiert werden. 

Die Isolierung von Exosomen mit der differentiellen Ultrazentrifugation ist eine effektive und zuverlässige Methode zur hochreinen Anreicherung. Der mehrstufige Arbeitsablauf erfordert äußerste Präzision und Reproduzierbarkeit, sodass er ideal für die Automatisierung geeignet ist.  Wenn Sie mehr über die Automatisierung der Isolierung und Charakterisierung von Exosomen erfahren möchten, lesen Sie diesen Anwendungshinweis.

Literatur:

1. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.
2. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., and Mittelbrun, M. Sorting it out: Regulation of Exosome Loading. Semin. Cancer Biol. (2014) 28:3-13. doi:  10.1016/j.semcancer.2014.04.009.
3. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles. (2014) 3. doi:  10.3402/jev.v3.24858.
4. Lazaro-Ibanez, E., Sanz-Garcia, A. Visakorpi, T., Escobedo-Lucea, C., Siljander, P., Ayuso-Sacido, A., et al. Different gDNA content in the subpopulations of prostate cancer extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles, and exosomes. Prostate. (2014) 74:1379-90. doi: 10.1002/pros.22853.
5. Stevanato, L., Thanabalasundraram, L., Vysokov, N., and Sinden, J.D. Investigation of Content, Stoichiometry and Tarnsfer of miRNA from Human Neural Stem Cells Line Derived Exosomes. PLoS One. (2016) 11:e0146353. doi: 10.1371/journal.pone.0146353. 
6. San Lucas, F.A., Allenson, K., Bernard, V., Castillo, J., Kim, D.U., Ellis, K., et al. Minimally invasive genomic and transcriptomic profiling of visceral cancers by next-generation sequencing of circulating exosomes. Ann. Oncol. (2016) 27:635-41. doi: 10.1093/annonc/mdv604.
7. Winston, C.N., Goetzl, E.J., Akers, J.C., Carter, B.S., Rockenstein, E.M., Galasko, D., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimers Dement. (Amst). (2016) 3:63-72. doi: 10.1016/j.dadm.2016.04.001.
8. Lasser, C., O-Neil, S.E., Shelke, G.V., Sihlbom, C., Hansson, S.F., Gho, Y.S., et al. Exosomes in the nose induce immune cell trafficking and harbour an altered protein cargo in chronic airway inflammation. J. Transl. Med. (2016) 14:181. doi: 10.1186/s12967-016-0927-4.


Kontaktieren Sie uns


















Bitte informieren Sie mich weiterhin über Veranstaltungen, Aktivitäten, Produkten und Servicedienstleistungen der Beckman Coulter Life Science.


Mit dem Absenden dieses Formulars bestätige ich, dass ich die Datenschutzerklärung und die Nutzungsbedingungen gelesen und akzeptiert habe. Ich akzeptiere die Wahlmöglichkeiten zum Datenschutz, die sie sich auf meine persönlichen Daten beziehen, wie sie in der Datenschutzerklärung unter "Ihre Wahl des Datenschutzes" beschrieben sind.