Exosomen bringen Krankheitsmodelle auf die nächste Ebene: Von in vivo zu in vitro

Früher gehörten die Entwicklung eines Tiermodells und die Analyse der Gewebehistologie und -biochemie auf Änderungen der Proteinexpression zu den häufigsten Methoden der Untersuchung eines Krankheitsverlaufs. Doch eine kleine Entwicklung in der Zellbiologie wirkt sich derzeit stark auf die Art und Weise aus, wie wir über Krankheiten denken und diese untersuchen. Exosomen sind kleine (< 120 nm), membrangebundene Vesikel, die von Zellen in die interstitielle Flüssigkeit ausgeschieden werden. Diese Flüssigkeit umgibt die Zellen. Aufgrund der Art und Weise, wie sie gebildet werden (von Endosomen abgesondert und mit der Plasmamembran fusioniert), enthalten Exosomen eine Stichprobe der DNAs, RNAs und Proteine ihrer Herkunftszelle, einschließlich der Zelloberflächenmarker.1 Durch die Isolierung der Exosomen, typischerweise aus einer Flüssigbiopsie, ist es möglich, die in den Exosomen enthaltenen einzelnen Makromoleküle zu analysieren, um Schlussfolgerungen bezüglich der Gesundheit ihrer Herkunftszellen, -organe oder -organismen zu ziehen.2 Es ist also möglich, krankheitsspezifische Zelllinien zu kultivieren, Exosomen aus einem konditionierten Zellkulturmedium zu isolieren und von den darin befindlichen Proteinen, DNAs und RNAs ein Profil zu erstellen. Es ist nicht mehr notwendig, einer Maus eine Niere zu entnehmen, serielle Schnitte vorzunehmen oder einen Western-Blot durchzuführen und mit einem phänotypischen Krankheitsmarker zu färben.3 Ein höherer Durchsatz, geringere Kosten und humanrelevante, krankheitsspezifische Details - all dies sind Gründe, die Erforschung der Welt der Exosomen in Betracht zu ziehen.

 

Die Rolle der Exosomen bei der Erforschung von Krankheiten

So wie Exosomen von den meisten, wenn nicht sogar allen gesunden humanen Zellen ausgeschieden werden, so werden sie auch von ungesunden, gestressten und erkrankten Zellen abgesondert. Der Inhalt solcher Exosomen spiegelt folglich diesen ungesunden, gestressten oder erkrankten Status wider. Tatsächlich wurde anhand von Flüssigbiopsien bestätigt, dass zirkulierende Exosomen von Patienten mit bestimmten Krankheiten anomale Proteine4-6 und krankheitsfördernde Nukleinsäuren enthalten können.7, 8 Es wurde sogar nachgewiesen, dass dieser Status im Anschluss an eine Exosomentransfusion von Organismus zu Organismus übertragen wird.6

Während des Übergangs von Gesundheit zu Krankheit, verändern sich die in den Exosomen enthaltenen einzelnen Makromoleküle und spiegeln die veränderte Homöostase der Krankheitslast wider9, 10. Gleichzeitig steigt die Anzahl der ausgeschiedenen Exosomen;11 ein Phänomen, das durch erhöhtes intrazelluläres Natrium ausgelöst wird. Dabei handelt es sich eventuell um einem Versuch, Zellprobleme an nahegelegene Zellen zu übermitteln. Daher kann die Isolierung und Profilerstellung von Exosomen aus Zellen oder Geweben einer bekannten Pathologie Licht auf die biologische Funktion dieser zellulären Botschafter werfen. Darüber hinaus könnten auch neue mögliche therapeutische Ziele identifiziert werden, die zuvor undefiniert blieben.12

 

Rekapitulation einer Krankheit in vitro

Obwohl es stimmt, dass die Erforschung von Krankheiten mit Hilfe von Exosomen direkt anhand von Patientenproben (Urin, Speichel, Blut, usw.) durchgeführt werden, gibt es eine andere Methode zur Analyse des exosomalen Profils verschiedener Krankheiten. Es konnte nachgewiesen werden, dass Zelllinien in Kultur Exosomen in das Kulturmedium ausscheiden. Des Weiteren gibt es Hinweise darauf, dass die Exosomen, die aus Zelllinien gewonnenen wurden und Exosomen, die den Patienten entnommenen wurden bezüglich ähnlicher Diagnosen vergleichbar sind.13-17 Zelllinien, die von Patienten mit einer bestimmten Krankheit gewonnen wurden, scheinen ihr Exosomenprofil über einen bestimmten Zeitraum hinweg zu erhalten und scheiden beständig Exosomen mit der gleichen Zusammensetzung aus. Die Exosomenprofile mehrerer Krankheiten wurden charakterisiert,18-23 sodass die Extrapolation von Exosomen aus Zelllinien in Exosomen aus einer Flüssigbiopsie gestattet. Dadurch wird die Nutzung von nicht- bzw. minimalinvasiven Flüssigkeitsproben als Diagnosetests für Exosomen-Krankheitsbiomarker ermöglicht.

Zelllinien werden aus Gewebeproben gewonnen, für gewöhnlich im Anschluss an eine chirurgische Gewebebiopsie oder Resektion von erkranktem Gewebe. Einige krankheitsspezifische Zelllinien können aufgrund der von Tumorzellen gezeigten spontanen Immortalisierung über lange Zeiträume hinweg in Kultur überleben. Doch Zellen können auch im Labor durch Induktion der Expression eines Onkogens, wie z. B. E1A, immortalisiert werden. Auf diese Weise werden normale bzw. gesunde Zellen erschaffen. Andererseits sind primäre Zelllinien nicht unsterblich und können sich nur einige Male teilen, bevor sie entweder altern oder den Zelltod durchlaufen. Aus diesem Grund sind primäre Zellen keine ideal reproduzierbare Exosomenquelle für die Untersuchung in Kultur, da ihre Präparation nicht adäquat kontrolliert und repliziert werden kann. Die Best Practices geben den Vergleich von ausreichend ähnlichen Zelllinien vor, sodass nur der Krankheitsstatus das Exosomenprofil beeinflussen sollte;  für realistische Auswertungen sollten Exosomen, die von einer Melanom-Zelllinie erzeugt werden, mit Exosomen, die von einer Melanozyt-Zelllinie erzeugt werden, verglichen werden. Exosomen einer Darmkrebs-Zelllinie sind dafür nicht geeignet.

Manipulierte Zelllinien können für die Bildung von Exosomen verwendet werden. Dazu wird eine vorhandene Zelllinie mithilfe verschiedener molekularbiologischer und genomeditierender Techniken modifiziert und ihre Exosom-Fracht geändert oder spezifiziert. Beispiele für die Verwendung modifizierter Zelllinien zur Erzeugung spezifischer Exosomen umfassen die Konjugation von fluoreszierenden oder biolumineszenten Proteinen zur Nachverfolgung des Exosomtransports und Änderung der Sequenz von Frachtprotein, DNA oder RNA für die Downstream-Untersuchung der Exosomenfunktion.24

Phänotypische Analyse: Die Magie der Marker

Die Erzeugung und Isolierung von Exosomen ist nur der erste Schritt zur In-vitro-Charakterisierung von Krankheiten. Der nächste Schritt umfasst die Profilerstellung der isolierten Exosomen mit Hilfe einer Serie von phänotypischen Markern. So kann die Herkunftszelle des Exosoms bestätigt werden und gleichzeitig die Änderungen des Profils der Zelllinie im Krankheitsstatus mit dem Profil der Zelllinie im normalen Status verglichen werden. Die zur Charakterisierung der Exosomenprofile verwendeten phänotypischen Marker sind Antikörper, die in der Lipiddoppelschicht und dem vesikulären Kompartment des Exosoms entsprechende Proteine erkennen.

Obwohl keine Einigkeit über ein Panel von Markern herrscht, die die Identität eines Exosoms bestätigen können, gibt es mehrere Marker, die zur Identifizierung von Exosomen verwendet werden. Marker wie CD9, C81, MHC Klasse 2 sind einige der allgemein anerkannten Marker für Exosomen. Die Identifizierung von Exosomen kann auch ein Ausschlussprozess sein, bei dem auf GM130 und Calnexin positiv getestete, aus Teilen der Herkunftszelle gewonnene Mikrovesikel, ausgeschlossen werden. Diese spielen in der Exosom-Biogenese keine Rolle. Für spezifische Details der Herkunftszelle können Exosomen auch auf abstammungs- bzw. zelllinienspezifische Marker gefärbt werden. Dadurch kann der Zelltyp, aus dem sie ausgeschieden wurden, spezifisch identifiziert werden.

Die bildgebende Durchflusszytometrie ist eine übliche Methode zur Analyse phänotypisch identifizierter Exosomen. Sie kann die Größe und Form des Exosoms bestätigen. Exosomen können jedoch auch mittels Immunofluoreszenz, Elektronenmikroskopie, Western-Blot oder ELISA analysiert werden. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann ebenfalls zur Charakterisierung der Nukleinsäurekomponente von Exosomen verwendet werden.

Die Charakterisierung einer Krankheit mit Exosomen, die aus Zelllinien gewonnen wurden, bietet gegenüber herkömmlichen Methoden zur Analyse des Krankheitsstatus mehrere Vorteile. Dazu gehören ein höherer Durchsatz, geringere Kosten und direkte Anwendbarkeit auf die menschliche Krankheit. Weitere Informationen über Exosomen in der Krankheitsforschung, einschließlich der Verwendung von Exosomen als Nanomaterial für die Arzneimittelgabe, erhalten Sie unter dem folgenden Link: LINK ZUR ZUSAMMENFASSENDEN SEITE FÜR ARTIKEL ÜBER EXOSOMEN.

Literatur:

1. Keerthikumar, S., Gangoda, L., Liem, M., Fonseka, P., Atukorala, I., Ozcitti, C., et al. Proteogenomic analysis reveals exosomes are more oncogenic than ectosomes. Oncotarget. (2015) doi: 10.18632/oncotarget.3801.

2. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.

3. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

4. Emmanouilidou, E. and Vekrellis, K. Exocytosis and Spreading of Normal and Aberrant α-Synuclein. Brain Pathol. (2016) 26:398-403. doi: 10.1111/bpa.12373.
5. Fraser, K.B., Rawlins, A.B., Clark, R.G., Alcalay, R.N., Standaert, D.G., Liu, N., et al. Ser(P)-1292 LRRK2 in urinary exosomes is elevated in idiopathic Parkinson’s disease. Mov. Disord. (2016) doi: 10.1002/mds.26686. [Epub ahead of print]

6. Jeon, I., Cicchetti, F., Cisbani, G., Lee, S., Li, E., Bae, J., et al. Human-to-mouse prion-like propagation of mutant huntingtin protein. Acta Neuropathol. (2016) doi: 10.1007/s00401-016-1582-9.

7. Zhang, J., Li, S., Li, L., Li, M.,Guo, C., Yao, J., et al. Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function. Genomics Proteomics Bioinformatics. (2015) 13:17-24. doi: 10.1016/j.gpb.2015.02.001.

8. Ye, S.B., Li, Z.L., Luo, D.H., Huang, B.J., Chen, Y.S., Zhang, X.S., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human naspharyngeal carcinoma. Oncotarget. (2014) 5:5439-52. doi: 10.18632/oncotarget.2118.

9. Lin, J., Li, J., Huang, B., Liu, J., Chen, X., Chen, X-M., et al. Exosomes: Novel Biomarkers for Clinical Diagnosis. ScientificWorldJournal. (2015) 6557086:1-8. doi: 10.1155/2015/657086.

10. An, T., Qin, S., Xu, Y., Tang, Y., Huang, Y., Situ, B., et al. Exosomes Serve as Tumour Markers for Personalized Diagnostics Owing to Their Important Role in Cancer Metastasis. J. Extracell. Vesicles. (2015) 4:27522. doi: 10.3402/jev.v4.27522.

11. Zhang, X., Yuan, X., Shi, H., Wu, L., Qian, H., and Xu, W. Exosomes in cancer: small particle, big player. J. Hematol. Oncol. (2015) 8:83. doi: 10.1186/s13045-015-0181-x.

12. Valenzuela, M.M., Ferguson Bennit, H.R., Gonda, A., Diaz Osterman, C.J., Hibma, A. Khan, S., et al. Exosomes Secreted from Human Cancer Cell Lines Contain Inhibitors of Apoptosis (IAP). Cancer Microenviron. (2015) 8:65-73. doi: 10.1007/s12307-015-0167-9.
13. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., and Mongini, C. Emerging Roles of Exosomes in Normal and Pathological Conditions: New Insights for Diagnosis and Therapeutic Appliations. Front. Immuno. (2015) 6:203. doi: 10.3389/fimmu.2015.00203.14. Ipas, H., Guttin, A., and Issartel, J.P. Exosomal MicroRNAs in Tumoral U87 MG Versus Normal Astrocyte Cells. MicroRNA. (2015) 4:131-45. 15. Skog, J., Wurdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D.H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., et al. Glioblastoma microvesicle transport RNA and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat. Cell Bio. (2008) 10:1470-6. doi: 10.1038/ncb1800.16. Akers, J.C., Ramakrishnan, V., Kim, R., Phillips, S., Kaimal, V., Mao, Y., et al. miRNA contents of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in glioblastoma patients. J. Neurooncol. (2015) 123:205-26. doi: 10.1007/s11060-015-1784-3.
17. Jenjaroenpun, P., Kremenska, Y., Nair, V.M., Kremenskoy, M., Joseph, B., and Kurochkin, I.V. Characterization of RNA in exosomes secreted by human breast cancer cell lines using next-generation sequencing. PeerJ. (2013) 1:e201. doi: 10.7717/peerj.201.
18. Bellingham, S.A., Coleman, B.M., and Hill, A.F. Small RNA deep sequencing reveals a distinct miRNA signature released in exosomes from prion-infected neuronal cells. Nucl. Acids Res. (2012) 40:10937-49. doi: 10.1093/nar/gks832.
19. Belov, L., Matic, K.J., Hallal, S., Best, O.G., Mulligan, S.P., and Christopherson, R.I. Extensive surface protein profiles of extracellular vesicles from cancer cells may provide diagnostic sigantures from blood samples. J. Extracell. Vesicles. (2016) 5:25355. doi: 10.3402/jev.v5.25355.
20. Xiao, D., Ohlendorf, J., Chen, Y., Taylor, D.D., Rai, S.N., Waigel, S., et al. Identifying mRNA, MicroRNA and Protein Profiles of Melanoma Exosomes. PLOS one. (2012) 7: e46874. doi:10.1371/journal.pone.0046874.
21. Zhong, S., Chen, X., Wang, D., Zhang, X., Shen, H., Yang, S., et al. MicroRNA expression profiles of drug-resistance breast cancer cells and their exosomes. Oncotarget. (2016) doi: 10.18632/oncotarget.7481. [Epub ahead of print]
22. Taylor, D.D., and Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos. Trans. R. So.c Lond. B Biol. Sci. (2014) 369:pii: 20130503. doi: 10.1098/rstb.2013.0503.
23. Ogata-Kawata, H., Izumiya, M., Kuioka, D., Honma, Y., Yamada, Y., Furuta, K. et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. PLOS one. (2014) 9: e92921. doi:10.1371/journal.pone.0092921.
24. Hood, J. Post isolation modification of exosomes for nanomedicine applications. Nanomedicine. (2016) 11:1745-56. doi: 10.2217/nnm-2016-0102.


Kontaktieren Sie uns


















Bitte informieren Sie mich weiterhin über Veranstaltungen, Aktivitäten, Produkten und Servicedienstleistungen der Beckman Coulter Life Science.


Mit dem Absenden dieses Formulars bestätige ich, dass ich die Datenschutzerklärung und die Nutzungsbedingungen gelesen und akzeptiert habe. Ich akzeptiere die Wahlmöglichkeiten zum Datenschutz, die sie sich auf meine persönlichen Daten beziehen, wie sie in der Datenschutzerklärung unter "Ihre Wahl des Datenschutzes" beschrieben sind.