Entschlüsseln von Krankheiten mit Exosom-Biomarkern

Exosomen sind kleine (< 150 nm), zirkulierende, membrangebundene Vesikel, die mittels Endozytose von den Membranen von Zellen abgesondert und mittels Exozytose nach einer Membranfusion von multivesikulären Körperchen ausgeschieden werden1. Trotz ihrer geringen Größe enthalten Exosomen zahlreiche Informationen über die Gesundheit ihrer Herkunftszellen und -organe, sodass sie für Diagnoseanwendungen als Krankheitsbiomarker perfekt geeignet sind. Bei der Bildung verkapseln Exosomen eine kleine Stichprobe wesentlicher Zellkomponenten, wie Plasmamembran (einschließlich Oberflächenproteine), Cytosol, DNAs, RNAs (einschließlich mRNAs und microRNAs) und Proteine. 

Die Isolierung von Exosomen und die Analyse ihrer einzelnen Bestandteile kann für Krankheitsstatus übliche Modifikationen zeigen, wodurch eine frühere Erkennung und weniger invasive Diagnosen ermöglicht werden.

Minimalinvasive Methoden zur Krankheitscharakterisierung und -diagnose sind für einige Krankheiten, in denen der Zugang zu Probenmaterial nicht eingeschränkt ist, wie z.B. Blutkrebsarten und Hautkrankheiten, bereits üblich. Doch Exosom-Biomarker sind ein wesentliches Hilfsmittel für die Entwicklung minimalinvasiver Methoden zur Untersuchung der natürlichen Geschichte von Krankheiten, die begünstigtere Kompartments befallen, bei denen eine Probennahme schwierig ist, wie z. B. Hirn oder Rückenmark2-5, Nieren6-8 sowie Herz und Gefäße9, 10.

Exosomquelle

 Exosomen können aus fast jeder Flüssigkeit im Körper isoliert werden, doch – für einen optimalen diagnostischen oder prognostischen Wert – wählt man am besten eine Flüssigkeit, die sich in direktem Kontakt mit dem/den anvisierten Organ(en) befindet. Für eine Analyse des Krankheitsstatus des gesamten Körpers ist vernünftigerweise Blut die erste Wahl, da es die Flüssigkeit ist, die mit jedem Organsystem in Kontakt kommt. Andere biologische Flüssigkeiten, die erfolgreich auf ihren Exosomgehalt untersucht wurden, sind Fruchtwasser11, Muttermilch12, Speichel11, Tränenflüssigkeit13 und Urin14, 15. Diese so genannten Flüssigbiopsien, ein Begriff, der 1974 erstmals in der Fachliteratur auftauchte16, ermöglichen die nichtinvasive Überwachung der Funktion der Organsysteme durch die Zusammensetzung der sie umgebenden Flüssigkeiten, einschließlich ihres Exosomgehalts.

Die Reinheit von Exosompräparaten ist für zuverlässige und wiederholbare Analysen von höchster Wichtigkeit. Daher ist besondere Aufmerksamkeit auf die Reinheit von Exosomen enthaltenden Flüssigkeiten zu richten. Wenn Sie Ihre Flüssigkeitsprobe gewinnen, achten Sie darauf, eine versehentliche Kontamination Ihres reinen Flüssigkeitskompartments mit anderen biologischen Flüssigkeiten zu vermeiden. Diese Form der Kontamination ist bei einer Blutentnahme, bei der das Blut die Zielflüssigkeit ist, nicht so sehr von Belang, doch wenn Flüssigkeiten aus anderen Kompartments entnommen werden – wie dem Subarachnoidalraum der Wirbelsäule oder dem Synovialgelenk des Knies – sollten spezielle Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Kontamination Ihrer Probe mit Blut von der Nadel zu vermeiden. Sogar wenn Flüssigkeit nichtinvasiv entnommen wird – zum Beispiel durch sauberes Auffangen von abgelassenem Urin – sollten Best Practices zur Vermeidung einer Probenkontamination eingehalten werden.

Exosom-Isolierung

Es gibt derzeit mehrere allgemein angewandte Methoden zur Isolierung von Exosomen aus Flüssigbiopsien, darunter differentielle Ultrazentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Mikrofiltration, antikörperbeschichtete Magnetperlen und Mikroflüssigkeitsgeräte, wobei die differentielle Ultrazentrifugation als Goldstandard gilt.17 Da die differentielle Ultrazentrifugation die am häufigsten angewandte Methode zur Exosom-Isolierung ist, ist besonders auf die Bedeutung der Verwendung des richtigen Protokolls mit dem richtigen Rotor hinzuweisen, damit die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse sichergestellt ist.18

Tabelle 1. Vergleich der Methoden zur Exosom-Isolierung (übernommen aus 17)

Isolierungsmethode

Vorteile

Nachteile

Differentielle Ultrazentrifugation

Goldstandard, leicht anpassbar zur Berücksichtigung der Probenviskosität

Lange Schleuderdauer, kann Virus nicht von Exosom trennen, Kopräzipitation

Dichtegradientenzentrifugation

Weniger unerwünschte Kopräzipitation, spezielle Methoden ermöglichen die Trennung vom Virus

Nichtspezifische Präzipitation von Spezies derselben Größe

Mikrofiltration

Verbesserte Geschwindigkeit

Matrix-Membran-Interaktion, Kopurifikation von Proteinen, suboptimale Wiederfindung

Antikörperbeschichtete Magnetperlen

Hochspezifische Isolierung einer Exosomenpopulation

Nicht geeignet für großvolumige Proben, Exosomen eluieren möglicherweise nicht intakt von den Perlen

Mikroflüssigkeitsgeräte

Geringere Kosten, geringere Probenmenge erforderlich

Variable Effizienzen bei allen verfügbaren Protokollen

Welche Methode zur Exosom-Isolierung Sie auch wählen: Die Kunst der Exosom-Isolierung liegt darin, dass mehr nicht immer besser ist und dass der beste Leitfaden der gesunde Menschenverstand und die Erfahrung ist. Die Verwendung übermäßig stringenter Größenobergrenzen oder Antigenitätsanforderungen kann ebenso abträglich sein wie die Verwendung übermäßig hoher Größenobergrenzen oder Antigenitätsanforderungen. Denken Sie unbedingt stets daran, dass die Reinheit und Unversehrtheit der Probe höchste Priorität besitzen. Die Erhaltung einer reinen Exosomprobe erfordert in allen Stadien der Exosom-Isolierung Wachsamkeit, um einen Probenverlust zu vermeiden und die Zuverlässigkeit der Daten beizubehalten.

Wie bei jeder membrangebundenen Struktur, vom Exosom bis zur Tierzelle, kann eine raue oder fehlerhafte Handhabung zu einer Lyse führen, und eine versehentliche Lyse Ihrer Exosome, bevor Sie bereit sind, ist die Hauptursache für einen Verlust der Probe. Denken Sie daher stets daran, jeden Schritt Ihres Protokolls bei der empfohlenen Temperatur und im empfohlenen Puffer durchzuführen und halten Sie dabei Ihre Probe von Reinigungsmitteln und Matrix-Metalloproteasen fern.

Eine fehlerhafte Handhabung Ihrer Proben, besonders während der Waschvorgänge, kann zum Verlust Ihrer gesamten Probe führen. Markieren Sie stets Ihre Röhrchen, sodass der spezifische Schritt Ihres Protokolls vermerkt ist – dies kann dabei helfen, die Entsorgung eines Überstands, der wertvolle Exosomen enthält, oder das Wegwerfen eines Röhrchens, das einen Pellet enthält, der aufbewahrt werden sollte, zu vermeiden. Dies ist der häufigste Fehler, der in jedem Protokoll gemacht wird, das variable Schritte enthält, die Wäschen und Überstände umfassen. Gefahr erkannt, Gefahr gebannt – dies gilt auch, wenn man wohlüberlegt, achtsam und methodisch handelt.

Erstellung eines Krankheitsprofils mit Exosomen

Um einen Krankheitsverlauf mit Exosom-Biomarkern zu diagnostizieren oder nachzuverfolgen muss man zunächst eine Basis für ein gesundes oder nicht erkranktes exosomales Profil entwickeln. Dazu kann eine Populationsuntersuchung zur Beurteilung der Skala möglicher Variationen eines gesunden Profils gehören, eine longitudinale Studie des exosomalen Profils eines einzelnen Patienten vor und nach Einsetzen der Krankheit (was entweder äußerst viel Geduld oder Zufall erfordert) oder – und diese Option wird all jene interessieren, die keinen Zugang zu einer endlosen Versorgung mit Patienten haben, die keine Abneigung gegen Nadelstiche empfinden – ein Vergleich zwischen von einer „normalen“ Zelllinie und einer „erkrankten“ Zelllinie erzeugten Exosomen.
Zu den häufigeren bei der Diagnose und Prognose von Krankheiten zu verwendenden Exosom-Frachten gehören microRNAs (miRNAs), da ihr Vorhandensein oder Fehlen als Biomarker zur direkten Vorhersage des Risikos19, Beginns20, der Progression21 oder Remission22 einer Krankheit genutzt werden kann. Die Isolierung von miRNAs exosomaler Fraktionen wurde standardisiert23 und ist jetzt eine allgemein verwendete Methode zur Anreicherung auf krankheitsspezifische miRNAs aus dem ganzen Körper oder innerhalb eines spezifischen Organsystems.

Die Entschlüsselung von Krankheitsstatus mit Exosom-Biomarkern, ob in einer Zelllinie oder bei einer humanen Population, ist eine solide Technik, die Licht auf den wichtigsten prädiktiven Wert dieser zirkulierenden Botschafter wirft; Botschafter, die vor nicht sehr langer Zeit als verpackte Abfallentsorgungseinheiten abgeschrieben wurden. Eindeutig ist von diesen winzigen Botschaftern immer noch sehr viel zu erfahren. Weitere Informationen über die Exosom-Isolierung, Flüssigbiopsien und Krankheitsbiomarker finden Sie unter [Link zur Seite auf beckman.com noch festzulegen].
Beckman Coulter, das stilisierte Logo und die Produkte und Dienstleistungen von Beckman Coulter, die hier genannt werden, sind Handelsmarken oder eingetragene Warenzeichen von Beckman Coulter, Inc. in den USA und anderen Ländern. 

Literatur:
1. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22.

2. Gui, Y., Liu, H., Lv, W., and Hu, X. Altered microRNA profiles in cerebrospinal fluid exosome in Parkinson disease and Alzheimer disease. Oncotarget. (2015) 6:37043-53.

3. Fiandaca, M.S., Kapogiannis, D., Mapstone, M., Boxer, A., Eitan, E., Schartz, J.B., et al. Identification of preclinical Alzheimer’s disease by a profile of pathogenic proteins in neutrally derived blood exosomes: A case-control study. Alzheimers Dement. (2015) 11:600-7.

4. Jagot, F. and Davoust, N. Is it worth Considering Circulating microRNAs in Multiple Sclerosis? Front. Immunol. (2016) 7:129. doi: 10.3389/fimmu.2016.00129.

5. Zhang, Z.G. and Chopp, M. Exosomes in stroke pathogenesis and therapy. J. Clin. Invest. (2016) 126:1190-7. doi: 10.1172/JCI81133.

6. Bruno, S., Porta, S., and Bussolati, B. Extracellular vesicles in renal tissue damage and regeneration. Eur. J. Pharmacol. (2016) pii: S0014-2999(16)30427-7. doi: 10.1016/j.ejphar.2016.06.058. [Epub ahead of print]

7. Santucci, L., Bruschi, M., Candiano, G., Lugani, F., Petretto, A., Bonanni, A., et al. Urine Proteome Biomarkers in Kidney Diseases. I. Limits, Perspectives, and First Focus on Normal Urine. Biomark. Insights. (2016) 11:41-8. doi: 10.4137/BMI.S26229.

8. Junker, K., Heinzelmann, J., Beckham, C., Ochiva, T., and Jenster, G. Extracellular Vesicles and Their Role in Urologic Malignancies. Eur. Urol. (2016) 70:323:31. doi: 10.1016/j.eururo.2016.02.046.

9. Cheow, E.S., Cheng, W.C., Lee, C.N., de Kleijn, D., Sorokin, V., and Sze, S.K. Plasma-derived extracellular vesicles contain predictive biomarkers and potential therapeutic targets for myocardial ischemic injury. Mol. Cell. Proteomics. (2016) pii: mcp.M115.055731. [Epub ahead of print]

10. Kishore, R., Garikipati, V.N., and Gumpert, A. Tiny Shuttles for Information Transfer: Exosomes in Cardiac Health and Disease. J. Cardiovasc. Transl. Res. (2016) 9:169-75. doi: 10.1007/s12265-016-9682-4.

11. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A.K., Janssen, J.W., and Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. (2011) 9:86.

12. Admyre, C., Johansson, S.M., Rahman Qazi, K., Filen, S-J.,Lahesmaa, R., Norman, M., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J. Immunol. (2007) 179:1969-78. doi: 10.4049/jimmunol.179.3.1969.

13. Grigor’eva, A.E., Tamkovich, S.N., Eremina, A.V., Tupikin, A.E., Kabilov, M.R., Chernykh, V.V., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochemistry. (2016) 10:165-72.

14. Wiggins, R., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., and Beals, T. Lipid microvesicles and their association with procoagulant activity in urine and glomeruli of rabbits with nephrotoxic nephritis. Lab. Invest. (1987) 56:264-72.

15. Harpole, M., Davis, J., and Espina, V. Current state of the art for enhancing urine biomarker discovery. Expert Rev. Proteomics. (2016) 13:609-26.

16. Sorrells, R.B. Synovioanalysis (“liquid biopsy”). J. Ark. Med. Soc. (1974) 71:59-62.

17. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.

18. Livshits, M.A., Khomyakova, E., Evtushenko, E.G., Lazarev, V.N., Kulemin, N.A., Semina, S.E., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci. Rep. (2015) 5:17319. doi:10.1038/srep17319.

19. Ghanbari, M., Ikram, M.A., de Looper, H.W., Hofman, A., Erkeland, S.J., Franco, O.H., et al. Genome-wide identification of microRNA-related variants associated with risk of Alzheimer’s disease. Sci. Rep. (2016) 6:28387. doi: 10.1038/srep28387.

20. Zhang, T., Shang, Q., Lv, C., Wang, C., and Su, B. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2015) 463:60-3. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.05.017.

21. Farr, R.J., Joglekar, M.K., and Hardikar, A.A. Circulating microRNAs in Diabetes Progression: Discovery, Validation, and Research Translation. EXS. (2015) 106:215-44. doi: 10.1007/978-3-0348-0955-9_10.

22. Freres, P., Wenric, S., Boukerroucha, M., Fasquette, C., Thiry, J., Bovy, N., et al. Circulating microRNA-based screening tool for breast cancer. Oncotarget. (2016) 7:5416-28. doi: 10.18632/oncotarget.6786.

23. Lasser, C. Identification and Analysis of Circulating Exosomal microRNA in Human Body Fluids. Methods in Molecular Biology. (2013) 1024:109-28. doi: 10.1007/978-1-62703-453-1_9.

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