Die Isolierung von Exosmosen kann aufgrund der Hartnäckigkeit von Kontaminanten wie Mikrovesikeln, Lipoproteinpartikeln, Mikroben, Mikrosomen, Proteinaggregaten sowie von DNA und anderen Nekroseprodukten während des Reinigungsprozesses technisch herausfordernd sein.1 Dadurch ist eine genaue Charakterisierung von Exosomen und ihre Verwendung für Assays und andere Downstream-Anwendungen erschwert.1 Die Charakterisierung von Exosomen ist nicht nur für das Verständnis ihrer Eigenschaften und Funktion wichtig, sondern kann auch durch die Identifizierung von einzigartigen exosomalen Markerproteinen dazu beitragen, eine Methode zu entwickeln, mit der Proben auf das Vorhandensein von Exosomen beurteilt werden können. Die Standardisierung von Isolierungsmethoden verfügt über das Potenzial zu einer besseren Exosomquantität und –qualität, sowie, durch die Verwendung von Exosompräparaten, zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit zu führen. Obwohl Exosomen aufgrund ihrer potenziellen Rolle in der Krankheitsdiagnostik und -therapeutik Aufmerksamkeit erregt haben, ist die Bestimmung der Reinheit von Exosomproben eine absolute Notwendigkeit, bevor Exosom-Technologien in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden können, da Unreinheiten in Exosomproben unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen können. Im Rahmen der klinischen Diagnostik könnten Kontaminanten in der Probe zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen und somit eine Fehldiagnose des Patienten zur Folge haben.2

Exosom-Isolierungsmethoden

Exosomen werden von den meisten Zelltypen ausgeschieden und können daher sowohl aus einer Zellkultur als auch aus Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Urin, Speichel, Serum und zerebrospinale Flüssigkeit, isoliert werden.3 Protokolle für die Isolierung von Exosomen wurden für jeden Probentyp anhand von variierenden Parametern, wie Zentrifugationsgeschwindigkeit, Verwendung von Filtration und Dichtegradienten sowie anderen Techniken, angepasst.1 Die am häufigsten praktizierte Methode der Isolierung und Reinigung von Exosomen aus verschiedenen Quellen ist die differentielle Ultrazentrifugation,4 bei der eine Reihe von Schleuderdurchgängen zur schrittweisen Reduktion von Kontaminanten wie toten Zellen, Zellrückständen, Thrombozyten, Proteinen und Nukleinsäurekomplexen und -aggregaten sowie anderer Kontaminanten aus dem Isolat, führt.1 Nichtexosomale Kontaminanten, wie Lipoproteinpartikel, Viren und Bakterien, Mikrosome, DNA und andere Nekroseprodukte (wie z. B. apoptotische Körperchen) sowie Proteinaggregate können jedoch noch zurückbleiben.

Andere Techniken für die Exosom-Isolierung, die häufig zusammen mit der differentiellen Zentrifugation eingesetzt werden, umfassen: Iodixanol-Dichtegradient, Präzipitation, Ultrafiltration, Isolierung mittels Immunoaffinität, Größenausschluss-Chromatographie und mikrofluidische Techniken.5 Jede Methode hat Vor- und Nachteile, daher ist darauf zu achten, dass eine Methode ausgewählt wird, die der Downstream-Anwendung am besten gerecht wird. Darüber hinaus können einige Isolierungs- und Reinigungsmethoden die höchste Proteinausbeute ergeben, die Vesikel jedoch unbrauchbar für bestimmte Anwendungen machen.5 Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Größenausschluss-Chromatographie hochreine Proben mit relativ geringen Kontaminationen, Kosten und Verarbeitungszeiten hervorbringt. Die abschließende Probe kann jedoch stark verdünnt sein, es kann jeweils nur eine Probe verarbeitet werden und der Prozess kann laborintensiv sein.5

Nichtexosomaler Inhalt in einer Probe stellt eine große Herausforderung für die Analyse von Exosom-Charakteristika sowie für ihre Verwendung in Assays und anderen Ansätzen dar.1 Einige Kontaminanten, die schwer aus Vesikelpräparaten zu entfernen sein können, sind Lipoproteinpartikel, Mikroben, Mikrosome, Proteinaggregate sowie DNA und andere Nekroseprodukte.1 Je nach der vorgesehenen Downstream-Anwendung für die gereinigten Exosomen können weitere Schritte unternommen werden, um Kontaminanten aus der gereinigten Exosomprobe zu entfernen. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, dass mit einem Iodixanol-Dichtegradienten erzeugte Exosompräparate eine hohe Reinheit erzielen, wie durch die Anreicherung des exosomalen Markers CD63 und das Fehlen von kontaminierenden Proteinen, wie extrazelluläre Argonaute-2-Komplexe, belegt wurde.6 Eine übliche Methode zur Schätzung des kontaminierenden Proteins ist der Vergleich der Verhältnisses der Nanovesikelzahl (erzielt durch Vesikelvisualisierungstechnologien wie z. B. die NanoSight-Plattform) mit der Proteinkonzentration (erzielt mit kolorimetrischen Proteinassays wie z. B. dem BCA-Assay).7

Das Vorhandensein kontaminierender Proteine verändert dieses Verhältnis und kann daher eine Schätzung der Reinheit der Exosomprobe ermöglichen. Es wurde angegeben, dass Proben mit einem Verhältnis von größer als 3 x 1010 Partikel pro µg Protein als hochrein gelten, während Verhältnisse von 
2 × 109 zu 2 × 1010 Partikel pro µg Protein als wenig rein betrachtet werden.7 Für die Ausarbeitung eines Isolierungsprotokolls wird empfohlen, die Probe nicht nur auf Vorhandensein von Exosomen, sondern auch auf das Fehlen von kontaminierenden Faktoren zu beurteilen und zu optimieren.

Exosom-Charakterisierung

Zur Ermittlung der Exosomquantität und -reinheit und zur weiteren Charakterisierung von Vesikeln nach der Reinigung, werden mehrere allgemein übliche Strategien angewendet.5 Eine Analyse mit dynamischer Lichtstreuung (DLS), wenn diese zusammen mit analytischer Ultrazentrifugation angewendet wird, reichert basierend auf ihrem Lichtstreuungssignaturen, selektiv Exosomen innerhalb eines bestimmten Größenbereichs an. Die Massenspektrometrie kann zur Identifizierung von Proteinfrachten in Exosomen verwendet werden und kann bestimmen, ob die Probe Proteinaggregate oder andere Kontaminanten enthält.5 Die Elektronenmikroskopie kann zur Visualisierung der Vesikelmorphologie und -größe und, in Kombination mit der Immunmarkierung, spezifische Merkmale von Exosomen, wie z. B. Oberflächenproteinen, eingesetzt werden.1 Mit dem konventionellen Western-Blot-Verfahren kann das Vorhandensein bestimmter Proteine in der Probe erkannt werden, die Exosomquantität ist damit jedoch nicht festzustellen. Andere Techniken, die zur Bewertung der Qualität und Quantität von Exosompräparaten eingesetzt wurden, umfassen: Atomkraftmikroskopie (Rasterkraftmikroskopie), optische Einzelpartikelverfolgung, Durchflusszytometrie und Resistive Pulse Sensing.1

Eine Reihe von exosomalen Markern wurde identifiziert und zur Bestätigung des Vorhandenseins von Exosomen in Präparaten verwendet.8 Übliche Proteinmarker umfassen Alix, TSG101, CD9 und CD63. Andere Proteine, von denen man annimmt, dass sie in Exosomen angereichert sind, umfassen DIP2B und Mitglieder der 4-Transmembranprotein-Familie.2 Jedoch enthalten nicht alle Exosomen diese Proteine. Die Online-Datenbank ExoCarta (http://www.exocarta.org/) ist ein Tool, mit dessen Hilfe Forscher Exosom-Frachten identifizieren und charakterisieren können. Die Datenbank enthält Proteine, RNA-Sequenzen und Lipide, die in spezifischen Exosompräparaten identifiziert worden sind. Am Ende könnte die Identifizierung von Proteinmarkern von aus Tumoren gewonnenen Exosomen zum Beispiel dazu genutzt werden, Untersuchungen für die klinische Diagnose von Tumoren in Patienten zu entwickeln.

Die Standardisierung der Exosom-Isolierung und -Charakterisierung ist ein wesentlicher Schritt hin zu zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen aus Assays und anderen Downstream-Anwendungen, einschließlich klinischer und therapeutischer Anwendungen. Die Vielzahl an Quellen für die Exosomentnahme sowie die Vielfalt der Isolierungstechniken haben bezüglich der Standardisierung von Protokollen und Erzielung einheitlicher und reproduzierbarer Ergebnisse viele Herausforderungen dargestellt.1 Erfahren Sie, wie die Automatisierung des Arbeitsablaufs dazu beitragen kann, die Exosom-Isolierung und -Charakterisierung zu verbessern.

Literatur:

1. Witwer, K. W., Buzás, E. I., Bemis, L. T., Bora, A., Lässer, C., Lötvall, J., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.20360.

2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H.-J., Takahashi, N. and Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J. Clin. Invest. (2016) 126, 1152–1162. doi: 10.1172/JCI81129.

3. El Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O. and Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat. Rev. Drug Discov. (2013) 12, 347–357. doi: 10.1038/nrd3978.

4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G. & Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Editor. Board Juan Bonifacino Al (2006) Chapter 3, Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

5. Abramowicz, A., Widlak, P. and Pietrowska, M. Proteomic analysis of exosomal cargo: the challenge of high purity vesicle isolation. Mol. Biosyst. (2016) 12, 1407–1419. doi: 10.1039/c6mb00082g.

6. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.

7. Webber, J. and Clayton, A. How pure are your vesicles? J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.19861.

8. Mathivanan, S. and Simpson, R. J. ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics (2009) 9, 4997–5000. doi: 10.1002/pmic.200900351



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