Entwicklung und Herstellung viraler Vektoren: Antriebsimpuls für die Zukunft der Gentherapie

Produktion von viralen Vektoren mit Dr. Johannes van der Loo

Dr. Johannes van der Loo

Seit fast 40 Jahren scheint es so, dass die vielversprechende Gentherapie immer wieder einen Schritt nach vorne macht, gefolgt von zwei Schritten zurück.

Dank Wissenschaftlern wie Dr. Johannes (Han) van der Loo könnte sich dies bald ändern.

Dr. van der Loo gilt als Vorreiter bei der Entwicklung von Produktionsmodellen für virale Vektoren und sieht daher in den kommenden Jahren nur Vorwärtsimpulse für die Gentherapie. Und damit ist er nicht alleine.

Die Größe des Markts für Krebs-Gentherapie wurde 2015 auf 805,5 Millionen USD geschätzt, wobei eine durchschnittliche jährliche Wachstumsrate bis 2024 von über 20 Prozent angenommen wird.1Experten prognostizieren einen Markt für die Gentherapie im Jahr 2025 im Wert von 11 Milliarden USD.2

Das ist ein beeindruckendes Wachstum für ein Forschungsgebiet, in dem bisher nur fünf Therapien zur Anwendung zugelassen wurden und von denen nur eine außerhalb Asiens (und zwar nur in der EU) vermarktet wurde.2

Dr. van der Loo weist jedoch darauf hin, dass sich neue Gentherapien bereits in einem fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung befinden und weitere in der Pipeline sind.

Und es besteht ein vorwärtsgerichteter Impuls für die Gentherapie, der auch weiterhin wichtige Forschungsarbeiten zur Entwicklung sicherer viraler Vektoren für die Bereitstellung lebensrettender Behandlungen in der Zukunft vorantreiben wird.

Kategorien und Arten von viralen Vektoren

Dr. van der Loo erklärt, dass Gentherapie-Vektoren in drei grundlegende Kategorien unterteilt werden:

1. Integrierende virale Vektoren (z. B. Gammaretrovirus und Lentivirus), die sich in das Genom der Zielzelle integrieren und daher nach der Mitose in Tochterzellen repliziert werden.

2. Nicht-integrierende virale Vektoren (z. B. Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus), die episomal bleiben, wodurch das Potential für die Onkogenese verringert wird.

3. Nicht-virale Vektoren, wie z. B. Plasma-DNA. 

Andere häufige Arten von viralen Vektoren umfassen den Alphavirus, den Herpesvirus und Impfstoffe.

Bei der Auswahl eines viralen Vektors ist es laut Dr. van der Loo zunächst wichtig zu entscheiden, ob Sie einen integrierenden oder nicht-integrierenden Vektor benötigen.

„Wenn das Ziel beispielsweise eine hämatopoetische Stammzelle ist, die sich teilen und eine große Nachkommenschaft hervorbringen muss“, erklärt er, „ist der integrierende virale Vektor die beste Wahl, da das integrierte Gen in die Tochterzellen übernommen werden muss. Wenn das Gewebe jedoch aus sich nicht teilenden Zellen besteht, können wir einen nicht-integrierenden Vektor verwenden. "

Zusätzliche Überlegungen umfassen die Spezifität des viralen Vektors, die Art von Zellen, auf die abgezielt wird, und das Potential für Toxizitäts- und Genotoxizitätsprobleme.

Seit der im Jahr 2002 gemachten Entdeckung, wonach einige Patienten, die mit einem gammaretroviralen Vektor-vermittelten Gentransfer behandelt wurden, Leukämie aufgrund von Insertionsmutagenese entwickelten,3 stellte das Risiko der Genotoxizität ein Sicherheitsrisiko für die zellbasierte Gentherapie dar. Dieses Risiko ist nicht nur mit der Integration von retroviralen Vektoren, sondern auch nicht integrierenden Vektoren wie AAV verbunden.4 Obwohl eine geringe Immunogenität des AAV-Vektors bislang keine akuten Nebenwirkungen verursachte, löste er in mehreren klinischen Studien eine Immunotoxizität aus, die die therapeutischen Ergebnisse beeinträchtigen könnte.5,6

Schließlich ist es wichtig, die in-vitro- und in-vivo-Stabilität des Virusvektors zu berücksichtigen und den besten Prozess für die sichere Herstellung und Reinigung zu bestimmen. Und hier kommen Dr. van der Loo und seine Mitarbeiter ins Spiel.

Vergleich der Produktionsmethoden von viralen Vektoren

„Es gibt drei grundlegende Wege, um virale Vektoren zu produzieren: eine stabile Packungszelllinie, transiente Transfektion oder eine Infektion“, erklärt Dr. van der Loo. „Für Letzteres verweise ich auf das Baculovirus-System, das von Robert Kotin entwickelt wurde, als er am NIH forschte. Der Einfachheit halber werde ich mich in diesem Artikel nur auf die anderen beiden Methoden konzentrieren.“

Er beginnt damit, die Grundlagen zu skizzieren: Die Verwendung einer stabilen Produzentenlinie umfasst stabil integrierte Gag-/Pol- und Hüllgene, die zur Herstellung des Viruspartikels notwendig sind. Was fehlt, ist die Vektorsequenz selbst, die im Allgemeinen in Form eines Virus oder Plasmids eingeführt wird. Da die Verwendung eines Plasmids eine ineffiziente Methode zur Integration eines viralen Vektors ist, werden sie im Allgemeinen unter Verwendung eines Virus hergestellt.

Die Zellen werden anschließend gezüchtet, ein Klon wird ausgewählt und dann wird eine Master-Zellbank dieses Klons erstellt. Nachdem die Master-Zellbank hergestellt und zertifiziert wurde, werden die Zellen, wenn sie aufgetaut und in Kultur gebracht werden, den viralen Vektor produzieren.

Die Herstellung mit einer stabilen Produktionslinie ist relativ einfach und leicht zu skalieren. Im Allgemeinen besteht eine geringe Variabilität zwischen den Chargen, obwohl diese Methode von Natur aus weniger flexibel ist.

„Nachdem Sie den viralen Vektor und die Gensequenz ausgewählt haben, sind Sie daran gebunden“, sagt Dr. van der Loo, „denn wenn Sie Ihre Klone ausgewählt und Ihre Master-Zellbank erstellt haben, können Sie keine weiteren Änderungen mehr vornehmen.“

Im Gegensatz zur Verwendung von stabilen Produzentenlinien erfordert die transiente Transfektion nur drei Tage, wobei alle Vektoren von einer einzelnen Master-Zellbank erzeugt werden.

„Daher geht die Generierung einer Vektor-Charge relativ schnell und extrem flexibel, da der Vektor bis zum Zeitpunkt der Herstellung verändert werden kann“, sagt er.

Die Herstellung ist jedoch komplexer und schwieriger zu skalieren als bei Verwendung einer stabilen Produktionslinie, und eine größere Variabilität der Chargen ist möglich, wenn der Prozess nicht angemessen kontrolliert wird. Ein Grund dafür ist, dass der transiente Transfektionsprozess immer eine Plasmidkontamination einschließt, die während der Herstellung und Reinigung entfernt werden muss.

Reinigung von Viruspartikeln mittels Ultrazentrifugation

Eine Methode, mit der Dr. van der Loo und seine Kollegen virale Partikel reinigen, ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, die effektiv vollständige von leeren Virionen abscheidet. Als iso-osmotische Lösung kann Iodixanol für alle für dieses Verfahren erforderlichen Dichten verwendet werden.

Angesichts der kritischen Natur der nachgeschalteten Anwendung(en) ist die Verwendung der GMP für die Ultrazentrifugation unbedingt erforderlich. Man darf dabei nicht vergessen, dass Röhrchen und Kappen als nicht sterile Utensilien zur Verfügung gestellt werden und dass die Sterilisationsmethode - sei es Gamma-, Ethylenoxid- oder Hitze-Sterilisation - die Integrität des Röhrchens beeinträchtigen kann.

„Deshalb gehen wir immer die Informationen zur chemischen Kompatibilität und Sterilisation durch, die mit diesen Materialien mitgeliefert werden“, sagt er. „Und wenn dieser Prozess für klinische Studien späterer Phasen verwendet wird, muss die Methode validiert werden.“

Er fährt fort, den grundlegenden Reinigungsprozess zu beschreiben, den er und seine Kollegen benutzt haben:

„Nachdem wir das Virus eingeführt haben, das die geringste Dichte hat, unterfüttern wir es mit verschiedenen Konzentrationen von Iodixanol“, sagt er, „und stellen sicher, dass der Meniskus genau unter dem Nippel des Röhrchens liegt.“

„Das Röhrchen wird dann verschlossen und nach dem Schleudern sammelt sich das Virus in der 40 %-Iodixanol-Bande, die oberhalb der 54 %-Bande liegt. Nachdem wir eine Nadel in die Spitze eingeführt haben, um das Vakuum zu brechen, benutzen wir eine andere Nadel, um die Seite des Röhrchens zu durchdringen, um das Virus zu ernten.“

Da es sich dabei um einen nicht-sterilen Prozess handelt, ist es wichtig, den Rotor vor dem Lauf zu desinfizieren und das Röhrchen vor der Vektorernte abzuwischen. Zuletzt empfiehlt Dr. van der Loo die Filtration des Endproduktes mit mindestens einem 0,2 μm-Filter.

Er stellt außerdem fest, dass dieser Prozess eine ausgiebige Schulung erfordert, da er ebenso anspruchsvoll wie hochwirksam sein kann. „Wir haben diese Methode verwendet, um AAV-Vektoren für eine klinische Studie der Phase IIA erfolgreich zu produzieren“, sagt er, „wozu wir gezwungen waren, insgesamt 480 Iodixanol-Gradienten durchzuführen.“

Klinische Herausforderungen für die Verwendung von viralen Vektoren in der Gentherapie

Der Einsatz komplexer molekularer Prozesse, die durch Millionen von Jahren Evolution entstanden sind - sowohl unserer als auch den der Viren - ist nicht unproblematisch, wie Dr. van der Loo offen zugibt.

„Zunächst einmal ist es eine große Herausforderung, das für eine bestimmte Krankheit notwendige Maß an Genkorrektur zu identifizieren und zu erreichen“, sagt er. „Dazu gehören die benötigte Anzahl an Kopien, die Anzahl der zu integrierenden Vektoren und die Anzahl der Zellen, die transduziert werden können.“

„Zweitens ist es wichtig, das Expressionsniveau des therapeutischen Gens zu definieren; das hängt im Allgemeinen von der Wahl des Promotors ab - stark oder schwach -, der bestimmt, ob wir eine Expression auf hoher oder niedriger Ebene erreichen.“

"Das Dritte ist das Potenzial für die Insertionsmutagenese. Wir wissen, dass Vektoren, die in das Genom integriert sind, die Gene im Integrationsbereich beeinflussen können, und die Beseitigung der Möglichkeit einer Insertionsmutagenese ist eine fortwährende Herausforderung. "

„Eine vierte Herausforderung besteht in dem Gen-Silencing, das einen wichtigen Aspekt hinsichtlich der Integration von Vektoren, der Immunantwort auf einen Vektor (die die Wahl des Verabreichungsweges beeinflusst), des Vektor-Typs und der Vektorreinheit sowie der Bioverteilung betrifft.“

„Schließlich müssen wir die Off-Target-Expression berücksichtigen, auch wenn uns die Erfahrung gezeigt hat, dass die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren helfen kann, diese Herausforderung anzugehen.“

Andere gelernte Lektionen

Dr. van der Loo spricht über eine der wichtigsten Lektionen, die er nach vielen Jahren auf dem Gebiet der Gentherapie gelernt hat.

„Für klinische Studien früher Phasen ist es wichtig, risikobasierte Tests auf kritische Leistungskriterien aller Rohmaterialien durchzuführen und, falls möglich, eine Qualitätsvereinbarung mit allen Materialherstellern zu treffen.“

Er hat auch gelernt, wie wichtig es ist, beim Übergang von der Entwicklung zur GMP einen formalen Technologieprozess anzuwenden. „Und unterschätzen Sie niemals das hohe Niveau an technischem Training, das erforderlich ist, bevor Sie bereit für die Herstellung sind“, bemerkt er.

„Schließlich müssen Sie in skalierbare Technologien für die Großproduktion investieren. In einigen Fällen kann es sich dabei um eine Ultrazentrifugation handelt, oder es könnte sinnvoll sein, Alternativen wie die Chromatographie in Erwägung zu ziehen.

Literatur:
1. Verfügbar unter: URL: https://globenewswire.com/news-release/2016/09/13/871431/0/en/Cancer-Gene-Therapy-Market-size-to-exceed-4-3bn-by-2024-Global-Market-Insights-Inc.html.
2. Verfügbar unter: URL: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/gene-therapy-market-2015-2025/85.html.
3. Hacein-Bey-Abina, S, Hauer, J., Lim, A. et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N. Engl. J. Med 2010;363(4):355–364.
4. Kaeppel, C., Beattie, S. G., Fronza, R. et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nat Med 2013;19(7):889–891.
5. Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discov Med 2013;15(85):379–389.
6. Mingozzi, F., High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood 2013;122(1): 23–36.



Kontaktieren Sie uns


















Bitte informieren Sie mich weiterhin über Veranstaltungen, Aktivitäten, Produkten und Servicedienstleistungen der Beckman Coulter Life Science.


Mit dem Absenden dieses Formulars bestätige ich, dass ich die Datenschutzerklärung und die Nutzungsbedingungen gelesen und akzeptiert habe. Ich akzeptiere die Wahlmöglichkeiten zum Datenschutz, die sie sich auf meine persönlichen Daten beziehen, wie sie in der Datenschutzerklärung unter "Ihre Wahl des Datenschutzes" beschrieben sind.