CellMek SPS-System: Probenvorbereitungsleistung
Anteil von Gated-Populationen bei der automatisierten im Vergleich zur manuellen Probenvorbereitung in einem Workflow mit den Schritten Waschen/Färben/Lysieren & Fixieren/Waschen und einem 10-Farb-Antikörper-Panel in Flüssig- oder Trockenformat
Kelly Andrews, Gang Xu, Xizi Dai, Karen Lo, Jessica Ashbaugh, Jin Zhang, Ernesto StaroswieckiResearch and Development, Beckman Coulter Life Sciences, Miami, FL, USA
Workflow
Probenvorbereitung
Einleitung
Das CellMek SPS-Gerät ist ein automatisiertes Probenvorbereitungssystem für die In-vitro-Diagnostik in Durchflusszytometrie-Laboren, das auf die Verarbeitung von Vollblut-(WB-), Knochenmark-(BM-) und anderen relevanten Einzelzellproben für die nachgelagerte durchflusszytometrische Analyse ausgelegt ist.
Klinische Arbeitsabläufe umfassen in der Regel das Waschen eines Proben-Aliquots, Färben mit Flüssig- oder Trocken-Antikörpern, Lysieren von Erythrozyten und Fixieren von gefärbten Leukozyten (WBC), Waschen der lysierten/fixierten vorbereiteten Probe und Rekonstituieren in Puffer für die nachgelagerte durchflusszytometrische Analyse. Ein solcher Workflow, in dem alle Module des CellMek SPS-Geräts zum Einsatz kommen, wurde gewählt, um die Systemleistung im Vergleich zu manuell vorbereiteten Proben zu beurteilen. Verwendet wurden die folgenden Module: Probentransportmodul, Reaktionsplattenmodul, Zellwaschmodul, Trockenreagenzmodul, Flüssigantikörper-Modul, Vorbereitungsreagenzmodul und Ausgabemodul.
Methoden
WB, BM und andere Einzelzellsuspensionen (Liquor [CSF] und andere Körperflüssigkeiten) wurden von gesunden und kranken Spendern (97 Personen) gewonnen und mit einem repräsentativen Workflow mit den Schritten Waschen/ Färben/Lysieren & Fixieren/Waschen und einem individuellen 10-Farb-Antikörper-Panel entweder im Trockenformat unter Verwendung von DURACartridges oder im Cocktail-Flüssigformat verarbeitet. Das 10-Farb-Panel umfasste Kappa-FITC, Lambda-PE, CD10-ECD, CD5-PC5.5, CD200-PC7, CD34-APC, CD38-AA700, CD20-AA750, CD19-PB und CD45-KrO.
Tabelle 1. Individuelles 10-Farb-Antikörper-Panel in Flüssig- oder DURACartridge-Trockenreagenz-Format
| Antikörper-Panel | Marker- und Fluorochrom-Kombination (Flüssig- oder DURACartridge-Format) | |||||||||
| FITC | PE | ECD | PC5.5 | PC7 | APC | AA700 | AA750 | PB | KrO | |
| 10-Farber-Panel | Kappa | Lambda | CD10 | CD5 | CD200 | CD34 | CD38 | CD20 | CD19 | CD45 |
Die Proben wurden als Duplikate auf einem von drei CellMek SPS-Geräten vorbereitet, sodass jeweils insgesamt 152 Datenpunkte für CD45+-WBC und Gated-Untergruppen vorlagen (flüssig und trocken gepoolt). Jede mit dem CellMek SPS-Gerät verarbeitete Probe wurde mit einer Probe desselben Spenders, die mit einem gleichwertigen Workflow und gleichwertigen Reagenzien vorbereitet wurde, verglichen. Alle Daten der vorbereiteten Proben wurden auf einem Navios-Durchflusszytometer erfasst und mit der Kaluza C-Software ausgewertet. Der Vergleich der Messverfahren und die Abschätzung der Abweichung wurden von Biostatistikern durchgeführt.
Ergebnisse
Abbildung 1. Repräsentative Überlagerung von Punktdiagrammen von Proben, die mit dem CellMek SPS-System (grün) oder manuell (rot) hergestellt wurden. Die Punktgrößen der Kappa/Lambda-Diagramme wurden zur besseren Visualisierung vergrößert. Die Darstellungen dienen nur zur Veranschaulichung.
Tabelle 2. Klinische Spender
Proben von Patienten, die an hämatolymphoiden Malignomen erkrankt sind oder bei denen ein entsprechender Verdacht besteht; vom Pathologen als abnormal eingestuft. Diese werden als überschüssige Proben aus Krankenhäusern/Kliniken gewonnen.
(Klicken Sie auf die Untergruppe, um das Regressionsdiagramm zu sehen)
| Population | N | Manual Sample Preparation | Automated Sample Preparation | Difference | 95% Confidence Limits | |||||
| Mean | Min | Max | Mean | Min | Max | Lower | Upper | |||
| Lymphocytes | 67 | 29.08 | 5.35 | 80.16 | 27.49 | 5.83 | 75.83 | -1.58 | -1.99 | -1.17 |
| Monocytes | 67 | 7.42 | 0.72 | 25.29 | 8.24 | 0.77 | 26.60 | 0.82 | 0.60 | 1.05 |
| Granulocytes | 67 | 61.71 | 7.28 | 88.61 | 62.06 | 6.53 | 87.80 | 0.35 | -0.06 | 0.77 |
| CD10+ | 67 | 59.86 | 3.50 | 87.65 | 60.16 | 4.47 | 87.69 | 0.30 | -0.11 | 0.71 |
| CD34+ | 67 | 1.60 | 0.01 | 95.10 | 1.61 | 0.01 | 94.93 | 0.00 | -0.02 | 0.02 |
| CD200+CD19+(Ly) | 67 | 9.89 | 0.22 | 22.45 | 10.69 | 0.01 | 23.35 | 0.80 | 0.60 | 1.00 |
| CD38+ | 67 | 7.20 | 2.60 | 24.34 | 8.08 | 1.28 | 24.73 | 0.88 | 0.66 | 1.10 |
| CD20+CD200+(Ly) | 67 | 9.62 | 0.24 | 22.77 | 10.42 | 0.00 | 23.29 | 0.80 | 0.61 | 0.99 |
| CD5+CD19-(Ly) | 67 | 70.85 | 8.60 | 88.49 | 70.53 | 8.97 | 88.42 | -0.32 | -0.54 | -0.10 |
| CD19+CD20+ | 67 | 12.99 | 0.22 | 27.30 | 13.24 | 0.00 | 27.33 | 0.26 | 0.06 | 0.46 |
| Kappa+(CD19+CD20+) | 66 | 59.26 | 42.32 | 71.25 | 59.23 | 42.17 | 72.60 | -0.03 | -0.40 | 0.35 |
| Lambda+(CD19+CD20+) | 66 | 40.04 | 27.35 | 57.26 | 40.03 | 26.60 | 57.40 | -0.00 | -0.39 | 0.38 |
Tabelle 3. Klinische Spender
Proben von Patienten, die an hämatolymphoiden Malignomen erkrankt sind oder bei denen ein entsprechender Verdacht besteht; vom Pathologen als abnormal eingestuft. Diese werden als überschüssige Proben aus Krankenhäusern/Kliniken gewonnen.
(Klicken Sie auf die Untergruppe, um das Regressionsdiagramm zu sehen)
| Population | N | Manual Sample Preparation | Automated Sample Preparation | Difference | 95% Confidence Limits | |||||
| Mean | Min | Max | Mean | Min | Max | Lower | Upper | |||
| Lymphocytes | 31 | 17.55 | 3.03 | 54.91 | 17.69 | 2.83 | 50.76 | -0.15 | -0.37 | 0.66 |
| Monocytes | 31 | 10.47 | 1.45 | 89.78 | 10.97 | 1.61 | 88.52 | 0.51 | 0.18 | 0.83 |
| Granulocytes | 31 | 65.33 | 1.89 | 87.99 | 64.46 | 1.04 | 85.86 | -0.87 | -1.47 | -0.28 |
| CD10+ | 31 | 35.84 | 1.30 | 81.81 | 37.53 | 1.52 | 83.00 | 1.69 | 1.06 | 2.33 |
| CD34+ | 31 | 4.19 | 0.02 | 54.05 | 4.29 | 0.02 | 53.83 | 0.10 | -0.05 | 0.25 |
| CD200+CD19+(Ly) | 31 | 10.23 | 0.03 | 28.75 | 11.29 | 0.02 | 34.20 | 1.06 | 0.47 | 1.65 |
| CD38+ | 31 | 11.51 | 1.21 | 91.00 | 12.12 | 1.26 | 89.06 | 0.61 | 0.22 | 0.99 |
| CD20+CD200+(Ly) | 31 | 9.80 | 0.02 | 26.28 | 10.95 | 0.02 | 32.28 | 1.15 | 0.48 | 1.82 |
| CD5+CD19-(Ly) | 31 | 70.85 | 48.06 | 87.44 | 69.17 | 46.31 | 87.38 | -1.67 | -2.40 | -0.95 |
| CD19+CD20+ | 31 | 11.42 | 0.07 | 30.65 | 12.12 | 0.06 | 35.77 | 0.70 | 0.11 | 1.28 |
| Kappa+(CD19+CD20+) | 29 | 59.80 | 42.21 | 88.97 | 60.30 | 45.73 | 86.74 | 0.50 | -0.49 | 1.48 |
| Lambda+(CD19+CD20+) | 29 | 37.40 | 11.12 | 47.01 | 37.41 | 13.20 | 47.59 | 0.01 | -1.02 | 1.05 |
Erwartete Ergebnisse für die Gesamtabweichung gegenüber der Referenz bezogen auf den positiven Anteil:
- ± 5 Prozentpunkte Differenz bei Anteil der positiven Untergruppen ≤ 20 %
- ± 8 Prozentpunkte Differenz bei Anteil der positiven Untergruppen > 20 %
Tabelle 4. Abweichung bei Unterkomponenten gegenüber der manuell vorbereiteten Referenz bezogen auf den Anteil der positiven Gated-Untergruppen in Perzentilen
| Sub- component |
Group | Percentile | Level | Bias | 95% Confidence Limits | Acceptance Limit (±) |
Conclusion | |
| Lower | Upper | |||||||
| Sample Preparation Panel Design |
Typical Incubation |
25 | 5.895 | 0.493 | 0.380 | 0.606 | 5 | Pass |
| 50 | 20.263 | 0.349 | 0.216 | 0.483 | 8 | Pass | ||
| 75 | 56.340 | -0.012 | -0.294 | 0.269 | 8 | Pass | ||
| Throughput Optimized |
25 | 6.605 | 0.493 | 0.300 | 0.687 | 5 | Pass | |
| 50 | 25.505 | 0.176 | -0.030 | 0.381 | 8 | Pass | ||
| 75 | 58.765 | -0.384 | -0.713 | -0.054 | 8 | Pass | ||
| Instrument | 1 | 25 | 5.740 | 0.593 | 0.471 | 0.714 | 5 | Pass |
| 50 | 20.740 | 0.323 | 0.201 | 0.446 | 8 | Pass | ||
| 75 | 57.820 | -0.342 | -0.550 | -0.135 | 8 | Pass | ||
| 2 | 25 | 7.280 | 0.259 | 0.062 | 0.456 | 5 | Pass | |
| 50 | 27.240 | 0.322 | -0.062 | 0.707 | 8 | Pass | ||
| 75 | 54.820 | 0.410 | -0.345 | 1.164 | 8 | Pass | ||
| 3 | 25 | 7.445 | 0.280 | -0.011 | 0.571 | 5 | Pass | |
| 50 | 18.920 | 0.233 | -0.022 | 0.488 | 5 | Pass | ||
| 75 | 58.370 | 0.072 | -0.346 | 0.491 | 8 | Pass | ||
| Antibody Format |
Dry | 25 | 6.238 | 0.387 | 0.272 | 0.502 | 5 | Pass |
| 50 | 21.193 | 0.228 | 0.083 | 0.373 | 8 | Pass | ||
| 75 | 57.135 | -0.154 | -0.459 | 0.151 | 8 | Pass | ||
| Liquid | 25 | 5.850 | 0.703 | 0.519 | 0.886 | 5 | Pass | |
| 50 | 22.480 | 0.444 | 0.277 | 0.610 | 8 | Pass | ||
| 75 | 58.295 | -0.113 | -0.366 | 0.140 | 8 | Pass | ||
| Anti- coagulant |
ACD | 25 | 6.230 | 0.491 | 0.377 | 0.606 | 5 | Pass |
| 50 | 22.710 | 0.317 | 0.204 | 0.429 | 8 | Pass | ||
| 75 | 57.475 | -0.052 | -0.246 | 0.142 | 8 | Pass | ||
| EDTA | 25 | 7.565 | 0.523 | 0.416 | 0.631 | 5 | Pass | |
| 50 | 25.138 | 0.250 | 0.154 | 0.345 | 8 | Pass | ||
| 75 | 58.345 | -0.268 | -0.427 | -0.109 | 8 | Pass | ||
| Heparin | 25 | 6.855 | 0.130 | -0.045 | 0.304 | 5 | Pass | |
| 50 | 33.395 | 0.186 | -0.002 | 0.374 | 8 | Pass | ||
| 75 | 56.605 | 0.236 | -0.060 | 0.531 | 8 | Pass | ||
| None | 25 | 2.460 | 0.783 | 0.292 | 1.275 | 5 | Pass | |
| 50 | 12.208 | 0.537 | -0.056 | 1.130 | 5 | Pass | ||
| 75 | 50.065 | -0.419 | -1.758 | 0.919 | 8 | Pass | ||
| Specimen Type | BM | 25 | 5.255 | 0.682 | 0.516 | 0.849 | 5 | Pass |
| 50 | 20.280 | 0.423 | 0.255 | 0.592 | 8 | Pass | ||
| 75 | 55.660 | -0.187 | -0.498 | 0.124 | 8 | Pass | ||
| Body Fluid | 25 | 2.213 | 0.933 | 0.390 | 1.476 | 5 | Pass | |
| 50 | 10.648 | 0.699 | 0.040 | 1.357 | 5 | Pass | ||
| 75 | 48.283 | -0.347 | -1.932 | 1.237 | 8 | Pass | ||
| CSF | 25 | 4.140 | 0.010 | -1.006 | 1.026 | 5 | Pass | |
| 50 | 14.973 | -0.130 | -1.038 | 0.778 | 5 | Pass | ||
| 75 | 67.520 | -0.812 | -2.701 | 1.077 | 8 | Pass | ||
| WB | 25 | 7.390 | 0.347 | 0.266 | 0.428 | 5 | Pass | |
| 50 | 28.270 | 0.195 | 0.118 | 0.272 | 8 | Pass | ||
| 75 | 58.055 | -0.022 | -0.145 | 0.102 | 8 | Pass | ||
Schlussfolgerungen
Die Probenvorbereitungsleistung des automatisierten Prozesses mit dem CellMek SPS und des manuellen Vorbereitungsprozesses ist ungeachtet häufiger Quellen von Variabilität gleichwertig. Die Gesamtabweichung gegenüber der manuell vorbereiteten Referenz bezogen auf den Anteil der positiven Gated-Untergruppen lag bei Populationen ≤ 20 % in einem Bereich von ± 5 Prozentpunkten und bei Populationen > 20 % in einem Bereich von ± 8 Prozentpunkten. Die Unterkomponentenanalyse nach Paneldesign für die Probenvorbereitung (typische Inkubation oder durchsatzoptimiert), Gerät (1, 2 oder 3), Antikörperformat (flüssig oder trocken), Antikoagulans (EDTA, ACD, Heparin oder keines) und Probenmaterial (WB, BM, Körperflüssigkeit oder CSF) wurde an einem gepoolten Markerdatensatz beurteilt. Alle analysierten Unterkomponentenkategorien lagen für Populationen ≤ 20 % in einem Bereich von ± 5 Prozentpunkten und für Populationen > 20 % in einem Bereich von ± 8 Prozentpunkten.