Charakterisierung von viralen Vektoren

Bei der Zell- und Gentherapie wird ein Genabgabe-Vehikel eingesetzt, um ein Therapeutikum in den Körper einzuführen. Viele Gentherapieunternehmen arbeiten mit dem Adeno-assoziierten Virus (AAV) als Genabgabe-Vehikel ihrer Wahl. Das AAV ist ideal, da die viralen Kapside modifiziert werden können, um eine therapeutische Last zu transportieren. Die Forscher müssen zunächst bestimmen, wie viel Prozent ihrer viralen Kapside intakt sind. Dann müssen sie verstehen, wie viele intakte virale Kapside voll sind. Diese transgene Last ist für den Erfolg der Therapie entscheidend.

empty capsid, partial capsid, full capsid the ultimate goal viral vector characterization with auc

Es ist besonders wichtig für Forscher, die Viruslast dieser Partikel zu verstehen, da es unwahrscheinlich ist, dass Viruspartikel, die nicht das gesamte therapeutische Zielgen enthalten, therapeutische Aktivität hervorrufen. Stattdessen können diese partiellen Kapside unerwünschte Reaktionen hervorrufen, beispielsweise eine immunogene Reaktion. Die Forscher müssen die Qualität und Reinheit eines bestimmten Viruspräparats verstehen und viele wenden sich für dieses Wissen der analytischen Ultrazentrifugation zu.

Die Lösung zur Messung der rAAV-Vektorhomogenität, -Reinheit (und mehr): Analysieren gelöster viraler Partikel.

Rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) könnten vielversprechend für neue, lebensrettende Gentherapien sein.

Während allerdings klassische Techniken wie die dynamische Lichtstreuung (DLS) oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromography, HPLC) die Heterogenität und Aggregation von rAAV zwar charakterisieren können, liefern sie einfach keine ausreichende Auflösung für die Quantifizierung der Homogenität und der viralen Partikelbelastung. Bei der Herstellung von rAAV-Vektorpräparaten mit klinischer Qualität ist es immer ein Hindernis gewesen, hochauflösende Messungen zu erreichen.

Wie Gentherapie-Forscher wissen, ist ein schnelles Versagen wesentlich, wenn in der frühen Produktentwicklung so viel auf dem Spiel steht. Die Einführung der analytischen Ultrazentrifugation ermöglicht im Gegensatz zu den anderen üblichen Technologien die Herstellung von rAAV-Vektoren in klinischer Qualität. 

Das Haupthindernis? Fehlen einer hochauflösenden, quantitativen Technik zur Überwachung der therapeutischen Qualität in Bezug auf:

  • Homogenität
  • Reinheit
  • Produktkonsistenz
  • Virusfülle 

Die ideale Lösung: In-Solution-Analyse mit analytischer Ultrazentrifugation (AUC).
Wie Wissenschaftler bei Genethon herausgefunden haben, hilft die Möglichkeit - unabhängig von Serotyp und Transgen -, Matrix-freie Analysen von rAAV-Vektorpräparaten durchzuführen, dabei:

  • den viralen Zusammenlagerungszustand oder die Homogenität zu bestimmen 
  • die Aggregation empirisch zu quantifizieren
  • die Subpartikelverunreinigung zu bestimmen
  • die Masse zu quantifizieren, um die genetische Belastung genau zu messen

Sehen Sie sich dieses Webinar an, um zu erfahren, wie Christine Le Bec von Genethon und ihr Team die AUC genutzt haben, um scAAV- und ssAAV-Vektoren - einschließlich Homogenität und Viruspartikelladung - erfolgreich zu charakterisieren.

 

Analytical Methods to Measure Empty and Full AAV Particles

 

As gene therapy approaches usually require large amounts of AAV vectors for clinical use, few manufacturing processes have been reported to provide high titer and potent quantities of products. The dose control of AAV vectors is commonly established on titration methods relying either on the quantitation of DNA (viral genome) or transgene expression following cell transduction (infectious genome). However, AAV vector lots are generally a heterogeneous mixture of empty particles (i.e. do not contain DNA) and full particles (i.e. contain DNA). Therefore, it could be considered that empty particles are product related impurities, which can impact on the immunogenicity profile of the product when high doses are administered to patients. Different indirect methods can be used to establish the ratio between full and empty AAV particles. The quantification of full capsids is performed by using qPCR based technology. The total particles can be evaluated by an ELISA assay, spectrometric analysis, ion-exchange chromatography or SDS-PAGE. However, these methods have limitations and are not applicable to all serotypes without performing a new development. Using analytical ultracentrifugation approach, we have developed a method to quantify simultaneously empty and full AAV particles as well as intermediate species containing fragmented or incomplete vector genome. We have applied this technique to AAV lots of different serotypes, several sizes of transgene and different process of production. Several examples of AAV vectors analysis will be presented showing that AUC could be implemented as a routine test to monitor AAV product quality and manufacturing consistency.

Produkte zur Charakterisierung der Virusvektoren

Optima AUC

 Die nächste Generation der AUC, die häufig bei der Virusvektor-QK verwendet wird, liefert die relative Menge/Prozentzahl der leeren, vollständigen und partiellen Kapside 

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